[發明專利]一種分析維生素C生產菌株傳代過程磷脂組變化的方法

有效

• 申請號: 201210044060.4
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102586386A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 元英進;楊潔;鄒旸;胡夢龍;呂亞金
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N30/02;C12R1/01;C12R1/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

發明領域

本發明屬于工業微生物領域，涉及一種分析維生素C生產菌株混菌傳代培養過程磷脂組變化的方法。

背景技術

隨著經濟發展和生活水平不斷提高，人類對健康越來越重視，各種維生素類保健品的需求量逐年增加。在各種維生素中，維生素C是一種高效抗氧化劑，參與人體新陳代謝中重要的生物合成過程，是維持機體營養、生長所必需的維生素。它還在藥品、食品和化妝品添加等方面有極為廣泛的應用。

目前，我國通過使用巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)混合發酵生產維生素C。其中，前者為伴生菌，后者為產酸菌。兩菌在混合發酵的過程中，通過相互作用促進產酸菌的生長和產酸。在不加入伴生菌時，產酸菌生長緩慢，產酸效率極低，不適合工業生產；而混合培養時，產酸菌也會影響伴生菌的生長和形態。改造兩菌相互作用模式，進一步提高發酵產物2-酮基-L-古龍酸(維生素C的前體)的產量，可以減少能源消耗和環境污染，極大的降低生產成本。

在兩菌混合培養中，它們之間的交流最先經由感受外界信號的細胞膜，再進一步傳遞到胞內，并產生一系列的信號事件。研究兩菌傳代培養，不斷強化相互作用的過程中，細胞膜磷脂組的變化，可從這一角度找到兩菌相互作用促進產酸的原因，并為進一步的菌種篩選和改造，以及生產工藝優化等提供支持。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種分析維生素C生產菌株傳代過程磷脂組變化的方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種分析維生素C生產菌株傳代過程磷脂組變化的方法，包括如下步驟：

(1)固體培養：

取10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)和10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)分別接種于固體培養基上，28-35℃，培養24h-48h；

(2)種子培養：

將經步驟(1)培養的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養，24h-48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；

將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/mL，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養，以24h-48h為傳代周期，以體積比為1％-10％為傳代比接入新的種子培養基中，傳代100-150天，在0-100或0-150天選3-5個取樣時間取3-5個樣；

(3)分純：

將步驟(2)獲得的3-5個傳代培養混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養基上，28-35℃培養24h-48h；再分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養24h-48h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；

(4)發酵：

將所述進化了的巨大芽孢桿菌、進化了的氧化葡糖桿菌以及混合的進化了的巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌分別接種到發酵培養基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/mL，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/mL，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養10h-15h；

(5)細胞磷脂組的提取：

①取在步驟(4)搖床振蕩培養10h-15h的三種細胞懸液100-200mL，1000-3000rpm離心3-10min，去除上清液，保留細胞，用pH＝7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液洗細胞1-3次，相同條件離心，去除上清，得到細胞；

②將步驟①所得細胞制成干粉，稱取200-300mg細胞干粉，置于離心管A中，加入0.5-0.8mL超純水，充分混勻；

③向離心管A中再加入2-4mL提取液，充分混勻；1000-3000rpm離心3-10min，使溶液分層，取下層有機溶劑層，置于離心管B中；

④重復步驟③2-4次，至細胞完全沉降；