[發明專利]一種分析維生素C生產菌株傳代過程磷脂組變化的方法

有效

• 申請號: 201210044060.4
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102586386A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 元英進;楊潔;鄒旸;胡夢龍;呂亞金
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N30/02;C12R1/01;C12R1/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種分析維生素C生產菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是包括如下步驟：

(1)固體培養：

取10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)和10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)分別接種于固體培養基上，28-35℃，培養24h-48h；

(2)種子培養：

將經步驟(1)培養的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養，24h-48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；

將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/mL，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養，以24h-48h為傳代周期，以體積比為1％-10％為傳代比接入新的種子培養基中，傳代100-150天，在0-100或0-150天選3-5個取樣時間取3-5個樣；

(3)分純：

將步驟(2)獲得的3-5個傳代培養混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養基上，28-35℃培養24h-48h；再分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養24h-48h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；

(4)發酵：

將所述進化了的巨大芽孢桿菌、進化了的氧化葡糖桿菌以及混合的進化了的巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌分別接種到發酵培養基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰cfu/mL，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹cfu/mL，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養10h-15h；

(5)細胞磷脂組的提?。?/p>

①取在步驟(4)搖床振蕩培養10h-15h的三種細胞懸液100-200mL，1000-3000rpm離心3-10min，去除上清液，保留細胞，用pH＝7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液洗細胞1-3次，相同條件離心，去除上清，得到細胞；

②將步驟①所得細胞制成干粉，稱取200-300mg細胞干粉，置于離心管A中，加入0.5-0.8mL超純水，充分混勻；

③向離心管A中再加入2-4mL提取液，充分混勻；1000-3000rpm離心3-10min，使溶液分層，取下層有機溶劑層，置于離心管B中；

④重復步驟③2-4次，至細胞完全沉降；

⑤向離心管B中，加入0.8-1.2mol/L?KCl水溶液0.5-1.5mL，充分混勻，2000-4000rpm離心3-10min，除去含水溶性雜質的上清；

⑥再向離心管B加入1-3mL超純水，充分混勻，2000-4000rpm離心3-10min，去上清；

⑦蒸餾或氮氣吹干步驟⑥所得混合物中的有機溶劑，得到總磷脂提取混合物；

⑧將所述總磷脂提取混合物溶于0.2-2mL儲存液中制成樣品，冷凍-40℃以下保存；

⑨檢測前，向所述樣品內加入磷脂標準品，使磷脂標準品終濃度為0.5-1.5μg/mL；

所述提取液是含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1-2∶1，所述二丁基羥基甲苯的質量分數為0.005-0.01％；

所述儲存液為含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1-4∶1，所述二丁基羥基甲苯的質量分數為0.005-0.01％；

(6)LC-MS檢測

采用LC-MS對步驟(5)獲得的加入了磷脂標準品的樣品進行檢測，得到維生素C生產菌株傳代過程的磷脂組的分子結構和含量數據；

(7)多元統計分析

將步驟(6)獲得的維生素C生產菌株傳代過程的磷脂組的分子含量數據，進行多元統計分析，得到區分不同傳代時間維生素C生產菌株的差異磷脂分子標志物；

(8)過程分析

將步驟(7)獲得的差異磷脂分子標志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析這些磷脂分子變化的規律，進而發現在混菌傳代培養過程中起關鍵作用的磷脂分子及相關代謝途徑，從而為以提高2-酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養條件優化提供方向。