[發明專利]抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的測定方法

無效

• 申請號: 201210043736.8
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102590428A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 吳笛;楊冬;羅靖雄
• 申請（專利權）人: 玉溪九洲生物技術有限責任公司
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

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技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的測定方法。

背景技術

抗毒素/抗血清（Antitoxin/Antiserum）是指采用特定的抗原免疫動物后，再收集高效價免疫血清，并經過提取、純化后，制備出含完整抗體（IgG）或抗體片段[F(ab’)₂]的免疫球蛋白制品。以用于預防和治療各相應疾病引起的感染。1890年Behring和Kitasato發現用注射過破傷風毒素的豚鼠或家兔的血清，注射給其它動物后可抵抗破傷風的感染和發病。1891年在德國柏林利用抗血清成功搶救白喉感染的女孩是抗血清用于臨床治療的開始。此后，許多新品種的動物免疫血清陸續問世，20世紀前半葉曾一度出現血清療法時代，抗血清治療達到頂峰。

隨著歷史的發展，抗毒素/抗血清制品范圍從早期的單純治療細菌外毒素疾病擴展至現在的抗病毒制品，如抗狂犬和天花血清。目前，馬免疫球蛋白在難治病種（狂犬、天花，破傷風、肉毒中毒）、含多種致病成分（蛇毒）、防止生物恐怖和病原學研究不清的疾病等方面具有重要作用。隨著歷史及技術的發展，該制品也從最早的抗血清、抗毒素發展為現在安全性很高的純化動物（馬）特種免疫球蛋白，其活性成分也從血清發展到抗體，進而又發展為免疫球蛋白的F(ab’)₂片段，產品的過敏反應顯著降低。

由于抗毒素/抗血清純度的提高，其中蛋白的含量相應降低，抗毒素/抗血清的穩定性有所下降，因此需向其中添加甘氨酸做為穩定劑，以保持抗毒素/抗血清的穩定。目前，國內外報道的氨基酸測定方法主要有高液相色譜法（HPLC），因HPLC具有較高的靈敏度和特異性，操作較簡易，儀器設備要求適中，但抗血清/抗毒素中甘氨酸測定的相關方法未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的測定方法，該方法能準確地測定抗毒素/抗血清中甘氨酸含量，并且方法準簡便、快速。

本發明通過下列技術方案實現：一種抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的測定方法，包括分別吸取衍生化后的對照品溶液和衍生化后的供試品溶液，采用高效液相色譜法進行測定，再按常規方法測定甘氨酸和正纈氨酸的峰面積，以內標法計算，即得到抗毒素/抗血清中甘氨酸的含量，其特征在于所述衍生化后的對照品溶液和衍生化后的供試品溶液的制備經過下列各步驟：

（1）將內標物用水溶解，制成濃度為3～5mg/mL的內標物溶液；

（2）將對照品甘氨酸用水溶解，制成濃度為20～30mg/mL的對照品貯備液；在1.0mL對照品貯備液中加入9.0mL質量濃度為1.5%的磺基水楊酸，混勻后至少靜置2小時，在3000轉/分的轉速下離心分離10min，取分離后的上清液0.4mL，用水稀釋至10mL，即得到對照品溶液；

（3）取供試品抗毒素、抗血清1.0mL，向其中加入9.0mL質量濃度為1.5%的磺基水楊酸，混勻后至少靜置2小時，在3000轉/分的轉速下離心分離10min，取分離后的上清液1.0mL，用水稀釋至10mL，即得到供試品溶液；

（4）分別取步驟（2）所得對照品溶液和步驟（3）所得供試品溶液各0.4mL，在各溶液中分別加水1.6mL，再分別加步驟（1）所得內標物溶液0.08mL后，渦旋混合15s，再分別加入1.0mL含三乙胺的乙腈溶液，三乙胺的濃度為1mol/L，混勻，接著分別加入1.0mL含異硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液，異硫氰酸苯酯（PITC）的濃度為0.1mol/L，渦旋混合30s，室溫放置1小時，最后分別加入正己烷4mL，振搖后放置10min，取下層溶液進行過濾，濾液即為衍生化后的對照品溶液和衍生化后的供試品溶液。

所述步驟（1）的內標物為α-氨基丁酸或纈氨酸。

所述采用高效液相色譜法的色譜條件為：反相液相色譜柱，以濃度為0.01～0.1mol/L?、pH為6.5的醋酸鈉溶液為流動相A，以乙腈︰水的體積比為90︰10～70︰30的乙腈-水溶液為流動相B，用流速為1mL/min的洗脫液進行梯度洗脫，并且采用紫外檢測器，檢測波長為245～265nm。

所述梯度洗脫的程序見下表：