[發明專利]一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法

無效

• 申請號: 201210043685.9
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102559616A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 李智濤;白永杰;高秀菊;董璠;馮艷銘
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/40;C12N15/63
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 張彬

技術領域??

本發明涉及諾如病毒，具體說是一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法。?

背景技術

諾如病毒(Norovirus，NoV)是由美國學者Kapikin，首先于1972年采用免疫電鏡方法，從發生于1968年在美國俄亥俄州諾沃克地區的一所學校暴發的胃腸炎病人的糞便標本中檢出，并以發現地名稱命名為諾瓦克樣病毒(Norwalk—like?virus，NLvS)。1995年，國際病毒分類委員會第六次分類報告中正式將諾如病毒列入杯狀病毒科、諾如毒屬。諾如病毒引起的腹瀉，具有發病急、傳播速度快、涉及范圍廣等特點。全年均可發生感染，常引起集體暴發，感染對象主要是學齡兒童和成人，本病的暴發大部分具有季節性，呈現秋冬季高發。諾如病毒是全球范圍內引起人類急性胃腸炎的最重要的病原之一，可導致嚴重的食品安全和公共衛生問題。諾如病毒感染與世界上超過90％的病毒性腹瀉相關。?

諾如病毒感染的流行特點：1、低感染劑量(<10個病毒粒子)；2、較長的排毒時間(viral?shedding)，甚至病人在癥狀消失后仍可排出病毒，這增加了二次傳播的風險；3、在較高的氯溶液和較寬的溫度(冷凍-60℃)條件下依然保持穩定；4重復感染，可能是由于諾如病毒毒株之間缺乏交叉保護作用和缺乏長效免疫。?

根據外殼蛋白序列的不同，諾如病毒可以分為5個基因組(genogroups)，其中能感染人的病毒株屬于GI、GII和GIV，總體來說，GII是優勢毒株。其中，GII-4為優勢基因型。20世紀80年代以前，諾如病毒的診斷方法主要有直接電鏡法以及免疫電鏡法、放射免疫法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)等。由于這些方法敏感性和特異性較低且材料來源有限，很難廣泛應用。自20世紀90年代以后，隨著諾如病毒的全基因序列測序的完成，相繼建立了多種靈敏、特異的診斷方法。(1)ELISA法。利用基因工程方法對諾如病毒株的重組衣殼蛋白進行表達，為諾如病毒的檢測和血清流行病學研究提供了簡便可行的方法。但由于不同株間衣殼蛋白抗原具有相當大的變異性，這降低了該法的特異性和敏感性，且材料來源有限，限制了該法的使用。(2)RT-PCR法。該方法是目前用于諾如病毒的最敏感、也是最廣泛的檢測方法。因為在檢測后能夠測序，所以在為確定感染源的分子流行病學研究和區別相似的暴發之間的連續時特別有用。最近，熒光定量RT—PCR由于具有靈敏和快速優勢，被應用于胃腸炎暴發時大量糞便樣品的檢測。但由于病毒的變異和重組，針對特定毒株的引物和探針不能檢測所有的毒株，常常導致漏檢，所以能夠檢測所有毒株的引物和探針的設計就顯得非常關鍵。由于諾如病毒潛在的傳染性及其RNA的不穩定性，所以研制無傳染性及穩定的質控標準品，對于諾如病毒RT-PCR?試劑盒的研發具有重要意義。?

???MS2噬菌體屬于正性單鏈RNA球形病毒，基因組由3569個核苷酸構成，編碼裝配蛋白、包膜蛋白、復制酶蛋白和裂解蛋白等四種蛋白質分子。?噬菌體由180個包膜蛋白單體、1個成熟酶蛋白分子和一個基因組RNA組成。研究發現MS2噬菌體包膜蛋白與操縱子RNA?序列有特異性相互作用，這種作用可引發噬菌體外殼的組裝，同時，將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內。如果將某一病毒RNA的cDNA連接于MS2噬菌體包膜蛋白基因cDNA下游，轉錄后將得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的特定病毒RNA轉錄本，操縱子RNA序列就可以引發噬菌體包膜蛋白組裝成外殼，并將攜帶有某一病毒RNA序列的噬菌體基因組包裝到包膜內，形成噬菌體病毒樣顆粒。在實際構建質粒表達載體時，需將噬菌體裝配蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆連接于表達載體啟動子下游，這樣，經過誘導表達后，所表達的包膜蛋白不僅作為病毒樣顆粒的結構成分，而且可作為基因表達調節因子和pac信號對表達過程進行調節，使包膜蛋白的表達和RNA的轉錄協調一致，此時，組裝所得噬菌體樣顆粒具有成熟特性，從而具有核糖核酸酶抗性。?

發明內容

本發明針對上述問題提供一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法，該病毒顆粒具有耐核糖核酸酶的特點，作為諾如病毒RT-PCR檢測的標準品和質控品具有很好的穩定性，易于保存和運輸，對諾如病毒的基因診斷試劑盒的開發具有較強的實用價值。?

本發明一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒，由MS2噬菌體外殼蛋白包裹諾如病毒RNA的一種RNA-蛋白復合體；其內含有諾如病毒ORF1和ORF2之間保守基因區RNA序列，可表達諾如病毒GⅡ-4型保守區基因，具有耐核糖核酸酶的特性。?

一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其具體制備步驟為：?