[發明專利]一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法

無效

• 申請號: 201210043685.9
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102559616A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 李智濤;白永杰;高秀菊;董璠;馮艷銘
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/40;C12N15/63
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 張彬

1.一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于：其具體制備步驟為：

步驟一、pET-28b/MS2重組質粒的構建:

1)設計PCR擴增MS2噬菌體的MS2基因的引物，并進行人工合成，其序列分別為：上游引物：5’-ATCCATGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCG-3’，

下游引物：5’-GCGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3’，下劃線所指為上下游引物分別引入的NcoⅠ和BamH??酶切位點；然后通過RT-PCR的方法擴增出MS2基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：3；?????????????????????????????????

2)采用限制性內切酶NcoⅠ和BamHⅠ分別雙酶切MS2基因和質粒pET-28b(+)，純化后進行連接，得到連接產物；

3)將上述步驟2）所得到的連接產物轉化導入大腸桿菌，挑陽性單菌落進行?PCR和雙酶切鑒定，確保重組質粒pET-28b/MS2構建的正確性,-20^OC保存鑒定正確的重組質粒pET-28b/MS2；

步驟二、pET-28b/MS2/NV重組質粒的構建:

1)?人工合成諾如病毒NV基因片段的正義鏈NV1和反義鏈NV2，其堿基序列如SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5；?分別在正義鏈的5’端加入BamHⅠ酶切位點，在反義鏈的5’端加入HindⅢ酶切位點；取等摩爾量的合成后的正義鏈NV1和反義鏈NV2加入同一個PCR管，混合均勻后置于94℃水浴10min，冷卻至室溫，使其退火為雙鏈，即合成了NV基因；

2)采用限制性內切酶BamHⅠ和HindIII分別雙酶切重組質粒?pET-28b/MS2和上述步驟1）所制備的NV基因片段，純化后進行連接，得到連接產物；

3)上述步驟2）所制備的連接產物轉化導入大腸桿菌，挑陽性單菌落提取重組質粒，分別進行PCR鑒定和三酶切鑒定，以確認pET-28b/MS2/NV重組質粒正確構建，并獲得含有pET-28b/MS2/NV重組質粒的陽性菌落；

步驟三、誘導表達與純化

將上述步驟二鑒定正確含有pET-28b/MS2/NV重組質粒的陽性菌落，重新涂布于含卡那霉素的LB平板，培養后挑取單菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，培養至A_600nm的檢測值為0.5～1.0時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，使其終濃度為0.4mmol/L，繼續培養5h，離心收集菌體；將菌體懸浮于TE溶液中，加入溶菌酶，使其終濃度為10mg/L，室溫放置20min，離心去除沉淀，向上清液加入核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶I，使兩者終濃度均為1mg/L，37^oC水浴1小時溶解DNA和RNA，然后采用聚乙二醇沉淀法進行操作，提取出的病毒樣顆粒物，即為本發明含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒，將其溶解于TE緩沖液，置于4℃儲存。

2.如權利要求1一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于：所述的MS2基因為可表達MS2噬菌體裝配蛋白和包膜蛋白的基因。

3.如權利要求1一種含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于：所述的NV基因片段的序列為GⅡ-4型諾如病毒基因序列最保守的ORF1和ORF2的交界區的131堿基，其堿基序列如SEQ?ID?NO：6。

4.一種用權利要求1所述方法制成的含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒，其特征在于:?含諾如病毒RNA片段的假病毒顆粒是由MS2噬菌體外殼蛋白包裹諾如病毒RNA的一種RNA-蛋白復合體；其內含有GⅡ-4型諾如病毒ORF1和ORF2之間保守基因區RNA序列，可表達諾如病毒GⅡ-4型保守區基因，具有耐核糖核酸酶的特性。