[發(fā)明專利]拓寬雙抗體夾心免疫檢測濃度范圍的方法及其試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210043004.9
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN103293299A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設計）人: 吳馮波
• 申請（專利權）人: 上海新波生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

技術領域

本發(fā)明涉及一種免疫檢測方法及其試劑盒，特別是涉及一種拓寬雙抗體夾心免疫檢測濃度范圍的方法及其試劑盒。

背景技術

結合標記物和游離標記物的分離是影響非均相免疫分析準確性和靈敏性的關鍵步驟，而固相免疫分析為此提供了一有效手段；在固相免疫分析中，固相材料既作為免疫試劑的載體，又作為免疫反應的場所，因此可以通過簡單的洗滌方式有效地分離游離標記物與結合標記物，從而方便地實現(xiàn)非均相免疫分析。自1967年Cattle等人首次將聚苯乙烯塑料固相引入常規(guī)免疫分析之后，固相免疫分析已經(jīng)得到廣泛的應用，目前已成為最成熟、最常見的免疫檢測模式。

當以固相免疫分析方式實施雙抗體夾心免疫檢測時，固相抗體(即捕獲抗體)及標記抗體的濃度和活性是影響檢測濃度范圍的重要因素。當固相抗體(即捕獲抗體)及標記抗體的用量和活性足以結合標本中的被測抗原時，雙抗體夾心免疫檢測的信號強度與待測抗原濃度往往呈現(xiàn)良好的線性關系；而當標本含有高濃度待測抗原，固相抗體(即捕獲抗體)及標記抗體的用量/活性相對不足，或者高濃度待測抗原引發(fā)的檢測信號超出儀器的線性檢測范圍時，校準曲線的信號強度與待測物濃度常常偏離線性關系，從而使免疫檢測失去準確定量高濃度端待測抗原的能力；此時，增加固相抗體(即捕獲抗體)及標記抗體的用量常?？梢跃徍瓦@一現(xiàn)象；但對于微孔和試管固相，可以增加的固相抗體的量往往非常有限，因此，增加標記抗體用量的方法往往為首選方法。但在實際操作中，增加標記抗體用量常常導致檢測信號過強而超出儀器的檢測范圍，同樣會使高濃度待測抗原的檢測失去準確性。

然而，目前為止，尚未見本發(fā)明所述的雙抗體夾心免疫檢測中的拓寬免疫檢測濃度范圍的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種拓寬雙抗體夾心免疫檢測濃度范圍的方法及其試劑盒。本發(fā)明以未標記的示蹤抗體稀釋已標記的示蹤抗體，通過提高示蹤抗體總濃度和降低檢測信號，使待測物抗原的可測濃度范圍得到拓寬。該方法不需要變更體系其他組分，實施簡便而有效，可解決常見的雙抗體夾心法不能準確測量高濃度待測物的問題。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的拓寬雙抗體夾心免疫檢測濃度范圍的方法，包括以下步驟：

(1)用捕獲抗體包被固相材料；

(2)以信號生成物質(zhì)標記抗體(示蹤抗體)；

(3)當校準品或樣本中的待測抗原濃度過高，導致標記抗體活性/濃度相對不足，或者檢測信號超出儀器的檢測上限時，使用未標記的示蹤抗體稀釋已標記的示蹤抗體；

(4)通過捕獲抗體及示蹤抗體，與校準品或樣本中的待測抗原發(fā)生免疫反應，形成雙抗體夾心復合物：捕獲抗體-待測抗原-示蹤抗體；檢測信號生成物質(zhì)產(chǎn)生的信號強度，用于檢測樣本中待測抗原的含量。

所述步驟(1)中，固相材料，包括：孔狀或管狀固相，微球狀固相，纖維膜；其中，孔狀或管狀固相包括：微孔，試管；微球狀固相包括：磁微球，乳膠微球；纖維膜包括：硝酸纖維素膜、尼龍膜。

步驟(1)中，包被的步驟，包括：

(a)將捕獲抗體溶解于包被緩沖液后，與固相材料接觸并靜置5～24小時；包被抗體的濃度范圍為1.0～10.0μg/ml。

(b)用含表面活性劑的緩沖液作為洗滌液，洗滌步驟(a)制備的捕獲抗體包被的固相材料后，加入含封閉蛋白的緩沖液，靜置3～12小時；

(c)棄去含封閉蛋白的緩沖液，干燥固相材料，完成捕獲抗體包被固相材料的制備。

其中，步驟(a)中，包被緩沖液包括：50mM?pH9.5?CB緩沖液，其中，該緩沖液中含有：50mM?Na₂CO₃-NaHCO₃、150mM?NaCl、0.05％的NaN₃；

步驟(b)中，含表面活性劑的緩沖液，包括：含0.1％?Tween-20的50mM?pH7.8?TSA緩沖液；其中，50mM?pH7.8?TSA緩沖液中含有：50mM?Tris、150mM?NaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

步驟(c)中，含封閉蛋白的緩沖液，包括：含0.5％酪蛋白的0.1％Tween-20的50mM?pH7.8TSA緩沖液。

所述步驟(2)中，信號生成物質(zhì)包括：酶、熒光物質(zhì)、稀土離子、化學發(fā)光物質(zhì)、電化學發(fā)光物質(zhì)；

其中，酶，包括：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶；

熒光物質(zhì)，包括：異硫氰酸熒光素、熒光素；