[發明專利]一種測定汞離子含量的分析方法

有效

• 申請號: 201210042065.3
• 申請日: 2012-02-23
• 公開（公告）號: CN102621317A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 鄧安平;王玉珍;楊紅
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙) 11341
• 代理人: 李濤

技術領域

本發明涉及抗汞離子單克隆抗體的制備及一種測定食品和環境中汞離子含量的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)，屬于環境安全監督或食品分析的研究領域。

背景技術

汞是一種對人體健康危害極大的重金屬元素。汞離子會沉積在腦、肝和其他器官中，產生慢性中毒，損害腎、腦、胃和腸道，甚至引起死亡。另外，汞元素及其化合物如甲基汞、乙基汞等能夠通過皮膚被吸收，引起口腔炎、齒齦炎和神經紊亂等疾病。汞被優先列在全球環境監控系統(GEMS)清單上，世界各國都花費大量的人力、物力和財力在開發和研究新型的檢測汞離子方法。

目前常用的檢測汞離子的方法有原子吸收/發射光譜法、誘導等離子質譜法、原子熒光光譜法、陽極溶出伏安法等，這些方法雖然靈敏度較高，但儀器昂貴，操作復雜。

酶聯免疫分析方法是一種建立在抗原與抗體之間特異性反應基礎上的分析方法，具有靈敏度高、特異性強、簡便、快速、可同時檢測大量樣品的特點，已廣泛應用于臨床、生物、食品和環境分析領域中。目前，酶聯免疫分析方法也已用于食品和環境中重金屬的檢測。

建立檢測重金屬的酶聯免疫分析方法的關鍵是制備出抗重金屬離子的特異性抗體，而抗體的制備又取決于免疫原。由于重金屬離子自身不能作為免疫原免疫動物，目前大多采用選擇一種合適的螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和反式-環己基二乙烯三胺五乙酸(CHXDTPA)等，使之與金屬離子配位，再與大分子蛋白結合，從而制備出免疫原。但這些螯合物的空間結構較大，金屬離子被包裹在其中。所產生的抗體能識別重金屬螯合物形成的外殼，對重金屬離子本身未必識別，因此抗體的特異性不夠高；另外在檢測樣品時，必須先加入一定量的螯合劑，使之與待測重金屬離子形成能被抗體識別的重金屬螯合物，從即使測定過程變得更為復雜。

由于汞與巰基具有很強的結合能力，本專利選用了一種帶有巰基和羧基的物質即6-巰基煙酸(MNA，分子結構見圖1)作為配體，利用其上的羧基，將配體與載體蛋白連接，再利用其上的巰基與氯化甲基汞相連，生成的甲基汞-MNA-載體蛋白用作免疫原及包被抗原；運用雜交瘤抗體制備技術，經動物免疫、融合、篩選等步驟，制備出抗汞離子的單克隆抗體并對抗體各種性能作了鑒定，建立了測定汞離子的間接競爭酶聯免疫分析法，并用于食品和環境樣品中汞離子的檢測。

發明內容

本發明的目的是制備抗汞離子的單克隆抗體，并建立一種測定食品和環境中汞離子含量的酶聯免疫吸附分析方法，其特點是基于抗原與抗體之間特異性反應而建立的分析方法。

本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外均為重量份數。

一種測定汞離子含量的分析方法，包括以下步驟：

步驟一：免疫原和包被抗原的制備；

步驟二：汞離子單克隆抗體的制備；

步驟三：優化實驗條件，建立測定汞離子的酶聯免疫吸附分析方法；

步驟四：ELISA對加標樣品中汞離子含量的測定。

其中，所述的步驟一包括：

取6-巰基煙酸MNA與等摩爾的N-羥基琥珀酰亞胺NHS和N，N’-二環己基碳二亞胺溶于N，N’-二甲基甲酰胺，反應過夜后離心，上清液緩慢加入40～80mg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA的碳酸氫鈉溶液中，攪拌反應2～4小時后，離心，上清液用0.01mol/L?PBS溶液透析，得到MNA-BSA或MNA-OVA混合液；然后將氯化甲基汞CH₃HgCl溶液緩慢滴入上述溶液，反應后混合液于0.01mol/L的(NH₄)₂CO₃溶液透析，凍干，于-4℃保存；其中CH₃Hg-MNA-BSA為免疫原，CH₃Hg-MNA-OVA為包被抗原。

其中，所述的步驟二包括：免疫、融合、篩選、單克隆抗體的生產。

其中，所述的步驟三包括：

(1)溶液配制；

(2)間接ELISA篩選單克隆抗體；

(3)間接競爭ELISA步驟；

(4)ELISA實驗條件的優化；

(5)ELISA的標準曲線及靈敏度；

(6)ELISA的特異性。

其中，所述(1)溶液配制包括：

(1)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；

(2)磷酸鹽緩沖液；

(3)酪蛋白溶液；

(4)磷酸緩沖液-吐溫儲備液；

(5)汞離子儲備液；

(6)底物溶液；