[發明專利]一種測定汞離子含量的分析方法

有效

• 申請號: 201210042065.3
• 申請日: 2012-02-23
• 公開（公告）號: CN102621317A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 鄧安平;王玉珍;楊紅
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙) 11341
• 代理人: 李濤

1.一種測定汞離子含量的分析方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一：免疫原和包被抗原的制備；

步驟二：汞離子單克隆抗體的制備；

步驟三：優化實驗條件，建立測定汞離子的酶聯免疫吸附分析方法；

步驟四：ELISA對加標樣品中汞離子含量的測定。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述的步驟一包括：

取6-巰基煙酸MNA與等摩爾的N-羥基琥珀酰亞胺NHS和N，N’-二環己基碳二亞胺溶于N，N’-二甲基甲酰胺，反應過夜后離心，上清液緩慢加入40～80mg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA的碳酸氫鈉溶液中，攪拌反應2～4小時后，離心，上清液用0.01mol/L?PBS溶液透析，得到MNA-BSA或MNA-OVA混合液；然后將氯化甲基汞CH₃HgCl溶液緩慢滴入上述溶液，反應后混合液于0.01mol/L的(NH₄)₂CO₃溶液透析，凍干，于-4℃保存；其中CH₃Hg-MNA-BSA為免疫原，CH₃Hg-MNA-OVA為包被抗原。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述的步驟二包括：免疫、融合、篩選、單克隆抗體的生產。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述的步驟三包括：

(1)溶液配制；

(2)間接ELISA篩選單克隆抗體；

(3)間接競爭ELISA步驟；

(4)ELISA實驗條件的優化；

(5)ELISA的標準曲線及靈敏度；

(6)ELISA的特異性。

5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(1)溶液配制包括：

(1)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；

(2)磷酸鹽緩沖液；

(3)酪蛋白溶液；

(4)磷酸緩沖液-吐溫儲備液；

(5)汞離子儲備液；

(6)底物溶液；

(7)H₂SO₄溶液；

(8)RPMI-1640培養液。

6.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(2)間接ELISA篩選單克隆抗體包括：

(a)用包被抗原以及對照抗原(MNA-OVA)包板，每孔100μL，4℃過夜；

(b)PBST緩沖液(PBST儲備液1∶10稀釋)滿孔洗滌三次；

(c)加入酪蛋白封阻，每孔120μL，4℃過夜；

(d)加入雜交瘤細胞上清，每孔50μL，37℃放置2小時；

(e)PBST緩沖液洗板三次；

(f)加入酶標二抗(羊抗鼠lgG-辣根過氧化物酶，GaMIgG-HRP)，每孔100μL，37℃放置1小時；

(g)PBST緩沖液洗板三次；

(h)加入底物液顯色，每孔100μL，振搖15-20分鐘；

(i)加入5％H₂SO₄溶液，每孔50μL，終止反應；

(j)用酶標儀測定吸光度值，對比兩種包被的吸光度值，進行結果分析與討論。

7.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(3)間接競爭ELISA步驟包括：

(a)用包被抗原包板，每孔200μL，4℃過夜；

(b)PBST緩沖液(PBST儲備液1∶10稀釋)滿孔洗滌三次；

(c)加入酪蛋白封阻，每孔280μL，室溫放置1小時；

(d)PBST緩沖液洗板三次；

(e)依次每孔加入100μL的標準溶液和100μL的一定稀釋度的單克隆抗體，室溫放置1小時；

(f)PBST緩沖液洗板三次；

(g)加入酶標二抗(GaMIgG-HRP)，每孔200μL，室溫放置1小時；

(h)PBST緩沖液洗板三次；

(i)加入底物液顯色，每孔200μL，振搖15-20分鐘；

(j)加入5％H₂SO₄溶液，每孔80μL，終止反應；

(k)用酶標儀測定吸光度值，做出標準曲線，進行結果分析與討論。