[發明專利]一種檢測食品中呋喃它酮代謝物含量的方法

有效

• 申請號: 201210042064.9
• 申請日: 2012-02-23
• 公開（公告）號: CN102621326A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 鄧安平;宋娟;楊紅
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: G01N33/64
• 分類號: G01N33/64;G01N33/531
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙) 11341
• 代理人: 李濤

技術領域

本發明涉及一種直接檢測食品中呋喃它酮代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)含量的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)，屬于食品安全監督或食品分析的研究領域。

背景技術

呋喃它酮(FTD)屬于硝基呋喃類藥物，是一種廣譜抗生素，曾被廣泛應用于家畜、家禽中痢疾、腸炎、球蟲病的預防和治療。但研究表明，該藥物具有嚴重的致癌等毒副作用，因此近十多年來世界各國陸續禁用該藥物并限定了殘留標準。然而國內外仍不時有呋喃它酮檢測超標的報道。呋喃它酮抗生素對光敏感，具有代謝快速的特點，在動物體內的半衰期不過數小時，通常不太可能檢出原藥殘留，而其代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)在體內較穩定，因此可通過檢測AMOZ的含量判斷是否存在違規使用呋喃它酮。

1990年歐盟頒布條例，規定硝基呋喃類藥物及其代謝產物在動物源性食品中的殘留檢測限為1.0μg/kg，而AMOZ的檢測限為300ng/kg。澳大利亞(1993)，菲律賓(2001)，巴西(2002)，泰國(2002)和美國(2002)也相繼頒布條例禁止其使用。我國農業部文件農牧發[2002]1號文件也規定動物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物為不得檢出。

AMOZ的檢測方法主要是色譜分析法。由于原藥化合物半衰期通常只有幾小時，而其代謝產物則可與動物組織中的蛋白結合而形成穩定的化合物，穩定期可長達幾個星期，因此，目前國內外報道多見于檢測其代謝物。由于硝基呋喃代謝產物分子量比較小，為了增加分子量和產生強紫外吸收，使結果更加精確，現有的分析方法多為先讓硝基呋喃代謝產物在酸性條件下水解，同時用2-硝基苯甲醛等衍生化試劑進行衍生化，所生成的代謝物的衍生物經提取和進一步凈化，再用高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-質譜(LC-MS)、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)等儀器進行檢測。我國質檢總局發布的國家標準(GB/T21311-2007)，將樣品在酸性條件下水解，同時用2-硝基苯甲醛進行衍生化，調pH＝7.4后，用乙酸乙酯提取生成的衍生物(NPAMOZ)，正己烷凈化，再用液相色譜-串聯質譜進行定性檢測，采用穩定同位素內標法進行定量測定。盡管色譜分析方法較準確，但色譜法儀器昂貴、樣品預處理復雜、費時、檢測成本高，而且不能直接測定食品中AMOZ含量。

酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)具有靈敏度高、特異性強、分析快速的優點，已廣泛用于臨床、藥物、食品和環境等分析領域。國內已有申請以多克隆抗體為基礎的ELISA測定食品中AMOZ含量的專利，申請號為200810219298.X。但是其仍然不能直接測定AMOZ，而需要用2-硝基苯甲醛進行衍生化后，再測定AMOZ與2-硝基苯甲醛形成的衍生物NPAMOZ。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種直接檢測食品中AMOZ含量的酶聯免疫吸附分析方法，其特點是基于抗原與抗體之間特異性反應而建立的分析方法。

本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外均為重量份數。直接檢測食品中AMOZ含量的酶聯免疫吸附分析方法：

一種檢測食品中呋喃它酮代謝物含量的方法，包括以下步驟：

步驟一：AMOZ修飾物的制備；

步驟二：免疫原和包被抗原的制備；

步驟三：AMOZ單克隆抗體的制備；

步驟四：建立測定AMOZ的酶聯免疫吸附分析方法；

步驟五：ELISA對加標樣品中AMOZ含量的測定。

其中，所述步驟一包括：

1)CPAMOZ?I的合成

稱取3-羧基苯甲醛加入反應瓶，用無水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮氣保護下反應5～12小時，取出，將反應液離心，棄去上層清夜，沉淀用冰無水乙醇洗滌后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，產物簡寫為CPAMOZ?I，其反應式如下：

2)CPAMOZ?II的合成

稱取4-羧基苯甲醛加入反應瓶，用無水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮氣保護下反應5～12小時，取出，將反應液離心，棄去上層清夜，沉淀用冰無水乙醇洗滌后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，產物簡寫為CPAMOZ?II，其反應式如下：

3)CPAMOZ?III的合成