[發明專利]篩選腫瘤早期診斷靶標的Small RNA-Seq庫的構建方法

在審

• 申請號: 201210041472.2
• 申請日: 2012-02-23
• 公開（公告）號: CN102586892A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 李春燕;董恩成;劉珍珍;呂雪梅;吳仲義
• 申請（專利權）人: 中國科學院北京基因組研究所
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/10;C12Q1/68
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技術領域

本發明涉及一種由血液樣本構建核酸靶標數據庫的方法，尤其是針對單一個體的小量血樣構建二代測序用Small?RNA-Seq庫的方法。?

背景技術

microRNA(miRNA)是細胞內由18-25個核苷酸組成的非編碼小RNA。miRNA通過與靶基因mRNA的3’UTR(untranslated?region)不完全互補結合，抑制靶基因的翻譯。日益增多的研究顯示多種miRNA可作為致癌基因和抑癌基因參與細胞的增殖，并可調控腫瘤干細胞的分化及腫瘤的遷移過程。miRNA在多種癌癥的起始和發生發展過程中發揮著重要作用。對miRNA在癌癥發生發展的作用機制的研究已成為近年生物醫學領域的前沿熱點課題。?

目前絕大多數與癌癥相關的microRNA(miRNA)的研究是利用腫瘤組織和相鄰組織，通過比較兩者miRNA的表達水平，尋找與癌癥相關的miRNA，并進一步揭示miRNA的功能。但是這種研究方法取材不方便，對病人的創傷較大，不適于早期診斷。此外，由于取材范圍小，代表性和重復性有限。因此，需要開發新的診斷方法。已有研究顯示血液中的某些miRNA可作為多種癌癥(肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌、淋巴癌、乳腺癌等)診斷的潛在生物學標記。目前關于血液中miRNA的研究方法可分為三類：?

1.在血液(血清或血漿)中通過qRT-PCR技術檢測已報道的腫瘤組織中異常表達的miRNA表達是否也異常。這種方法的局限是：a.在血液中不確定能檢測到腫瘤組織中異常表達的miRNA。b.血液和腫瘤組織中的miRNA異常表達的趨勢不一定一致。已有研究發現，腫瘤細胞從血液中獲得對腫瘤生長有利的miRNA，從而使腫瘤組織內此miRNA的含量上調，血液中反而下調。?

2.利用miRNA芯片技術，在血液(血清或血漿)中檢測已知miRNA的表達水平。這種方法的局限性是：a.僅能檢測已知的miRNA的表達水平。b.此方法對表達量過低或過高基因的區分度較差。?

3.利用RNA-Seq技術，在血液(血清或血漿)中尋找可作為癌癥早期診斷標記物的miRNA。這種方法的優點是：a.不僅可以檢測已知miRNA的表達。還可分析未知miRNA的表達。b.RNA-Seq技術對基因表達量的分析比較準確，對表達量高或低的基因均有區分度。但是就目前建庫的方法，需要的血液量較多，大約需要100ml血液，因此需要將相同癌癥類型的多個個體的血液混臺在一起建庫、測序。因此這種方法的缺點是某個個體的異常表達可能導致平均值的上升或者下降，造成假陽性或假陰性，從而增加了后期驗證的工作量。?

發明內容

基于上述現有技術的不足，也為了進一步提高在血液中尋找生物學標記物的準確性，本實驗室通過對經典RNA-Seq建庫技術多方面的改進，最終僅使用少量血液(4-10ml)即可完成建庫工作的目的。這種技術突破讓使用單一個體少量血液進行RNA-Seq成為可能，不僅可以更快速直接地尋找相同癌癥患者發生共性變化的miRNA，還可以通過分析不同個體間表達的差異，避免由于某個具體的個體發生顯著變化而引入的假陽性和假陰性，因此大大提高尋找到的生物學標記物的準確性，減少對生物學標記物后期驗證的工作量。?

本發明提供一種針對單一個體的小量血樣構建二代測序Small?RNA-Seq庫的方法，所獲得的核酸數據庫能夠適用于靶標篩選和目標物(特別是小片段的RNA目標物)的診斷。?

本發明還涉及所述的建庫方法用于制備針對特異性疾病的診斷試劑盒的應用。?

本發明還涉及使用所述的建庫方法獲得的針對特異性疾病的診斷試劑盒。?

本發明所述的特異性疾病可以是肝癌、結直腸癌肝轉移、乳腺癌和結直腸癌等。?

本發明所述的針對單一個體的小量血樣構建二代測序Small?RNA-Seq庫的方法包括如下步驟：?

1.血漿分離操作?

取新鮮血液樣本，利用冷凍離心機，4℃分兩步從血液內分離血漿，400g～600g離心8～15分鐘，收集上清以去除血細胞；第二：1500g～2000g離心8～15分鐘以充分去除細胞碎片，收集上清。?

由于血裝內含有大量的RNase(RNA核酸酶)，因此，及時分離血漿后，-80℃低溫保存，可降低RNase對RNA的降解。從而減少rRNA和mRNA的降解片段對small?RNA分析的影響。?

2.總RNA提取?