[發(fā)明專利]篩選腫瘤早期診斷靶標的Small RNA-Seq庫的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210041472.2
• 申請日: 2012-02-23
• 公開（公告）號: CN102586892A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李春燕;董恩成;劉珍珍;呂雪梅;吳仲義
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院北京基因組研究所
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種針對單一個體的小量血樣構(gòu)建二代測序Small?RNA-Seq庫的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

步驟1).血漿分離操作：

對新鮮血液樣本，利用冷凍離心機，4℃從血液內(nèi)分兩步分離血漿，第一步：400g～600g離心8～15分鐘，收集上清以去除血細胞；第二步：1500g～2000g離心8～15分鐘，收集上清以充分去除細胞碎片；

步驟2).總RNA提取取；

對步驟1所獲得的血漿樣本，使用TRIZOL抽提3-4次以去除蛋白，抽提完成后加入異丙醇和肝糖，-80℃沉淀過夜，乙醇洗滌沉淀后用無核酸酶污染的雙蒸水重懸沉淀，并進一步濃縮該RNA溶液；

步驟3).3’adapter和5’adapter連接：

3’adapter連接：在步驟2)獲得的總RNA中加入熱激后的3’Adapter和連接試劑，于PCR儀上孵育連接；

在連按反應(yīng)獲得的溶液中加入RTprimer，于PCR儀上孵育；

5’adapter連接：熱激后的5’Adapter與上步反應(yīng)獲得的溶液混勻加入相應(yīng)的連接試劑，置于PCR儀上，孵育連接；

利用RNA濃縮法去除溶液中的連接緩沖液、多余的鹽離子等，得到與5’和3’Adapter連接的RNA；

步驟4).反轉(zhuǎn)錄合成cDNA與PCR擴增：

反轉(zhuǎn)錄：在PCR管中加入來自步驟3)與5和3’Adapter連接的RNA和相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄試劑，混勻，置于PCR儀上，孵育獲得cDNA片段，并用PCR擴增所獲得的DNA片段

步驟5).電泳及膠回收：

使用TBE-PAGE膠電泳上述步驟4)獲得的DNA片段，將片段大小在140bp左右的DNA片段切下，并回收其中的DNA，獲得的DNA片段即可用于目的樣本中的samll?RNA的建庫與進一步的檢測分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的血液樣本為來源于單一個體的8ml新鮮血液樣本，每8ml樣本可分離的血漿量為4ml。

3.根所權(quán)利要求1-2任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的TRIZOL抽提步驟為：對血漿樣本加入相應(yīng)體積的TRIZOL，混勻后靜置，然后加入氯仿，混勻后靜置，離心分離上清；經(jīng)濃縮后，每4ml步驟1)所獲得的血漿最終濃縮為4.6μl?RNA溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述3’Adapter連接時，來自步驟2)的4.6μl總RNA中加入1μl濃度為0.25nM的3’Adapter，使用PCR儀孵育，溫度22℃，時間2h；步驟3)所述加入RT?primer后的孵育步驟是：70℃5min，37℃30min，25℃15min；步驟3)所述的5’Adapter連接時，向之前獲得的連接溶液中加入1μl濃度為0.25nM的5Adapter，使用PCR儀孵育，溫度20℃，時間1h。

5.根所權(quán)利要求1-4任一所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中所述的PCR反應(yīng)步驟是：PCR儀首先預(yù)熱至65℃以上，首先95℃，5min；然后95℃10s、60℃30s、72℃30s循環(huán)18次；最后72℃孵育10min。

6.權(quán)利要求1-5任一所述的建庫方法用于制備針對特異性疾病的診斷試劑盒的應(yīng)用。

7.由權(quán)利要求1-5任一所述的建庫方法獲得的針對特異性疾病的診斷試劑盒。