[發(fā)明專利]用于診斷草魚呼腸孤病毒的三重PCR檢測引物組、試劑盒及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210039379.8
• 申請日: 2012-02-21
• 公開（公告）號(hào): CN102534050A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾偉偉;王慶;吳淑勤;王英英;張樂生;石存斌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及草魚呼腸孤病毒不同亞型的三重PCR檢測，包括檢測引物組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

草魚呼腸孤病毒（Grass?carp?reovirus，GCRV）隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤病毒科一新成員，是中國大陸分離的第一株魚類病毒。該病毒主要引起中國、越南、緬甸等亞洲國家淡水養(yǎng)殖中的草魚品種在魚種階段發(fā)生出血病，死亡率可高達(dá)60%以上。該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長，嚴(yán)重威脅漁業(yè)生產(chǎn)。草魚呼腸孤病毒具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60?nm-70nm，二十面體對稱，無囊膜，基因組由11條分節(jié)段的雙鏈RNA組成。目前己經(jīng)報(bào)道了近20個(gè)分離株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV?H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV?HZ08、GCRV??JX09-01、GCRV?JX09-02、GCRV?GD10、GCRV?GCRV104株等，不同分離株在基因組序列、基因組帶型、細(xì)胞病變、對草魚的致病力等方面差異較大。到目前為止，有報(bào)道的只有GCRV?873株、GCRV?HZ08、GCRV?GD10已完成全基因組序列分析，而其它毒株只完成了部分節(jié)段或者部分序列的測序工作。草魚呼腸孤病毒比較復(fù)雜，不同分離株的各基因節(jié)段存在重配和抗原漂移現(xiàn)象，使得目前還沒在血清學(xué)或者基因型上對其進(jìn)行亞型分類。但是通過現(xiàn)有的分離株序列信息來看，至少應(yīng)該有三類，各類的代表株分別是：第一類為873株和JX09-01株，第二類為HZ08株和GD10株，第三類為104株。在相關(guān)的研究報(bào)道中已有提到將其進(jìn)行基因分型的探討,即分別把一、二和三類按照基因序列差異分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。（1、曾偉偉，王慶，劉永奎，等.一株草魚呼腸孤病毒弱毒株的分離、鑒定及免疫原性初步分析。水生生物學(xué)報(bào),2011.35(5):790-795；2、劉寶芹，曾偉偉，王慶，等.草魚呼腸孤病毒HZ08株FQ-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用）。同一亞型的毒株，其對應(yīng)各節(jié)段基因同源性均在95%以上。當(dāng)前，全國各地分離到的流行株中，三類亞型均有報(bào)道，有的單獨(dú)感染，也有混合感染。根據(jù)草魚出血病的流行特點(diǎn)和草魚呼腸孤病毒分子生物學(xué)特性，根據(jù)同一亞型不同毒株之間共有的保守序列分別設(shè)計(jì)引物，建立針對目前已知流行的所有草魚呼腸孤病毒均能同時(shí)作診斷，并且可以鑒定其亞型的三重RT-PCR快速、特異檢測技術(shù)。

病毒分離、電鏡觀察、核酸帶型分析至今仍是檢測草魚呼腸孤病毒普遍采用的方法，但這些方法操作比較復(fù)雜，不能對病毒進(jìn)行快速診斷，不利于草魚出血病及時(shí)有效防制。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對某片段基因進(jìn)行擴(kuò)大數(shù)百萬倍。該技術(shù)特異性強(qiáng)，敏感性高、檢測快速，已被廣泛用于醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等學(xué)科的各領(lǐng)域。多重PCR是一種特殊PCR形式，其最突出特點(diǎn)是一次PCR可同時(shí)檢測多種基因，尤其適用于病原復(fù)雜，基因型較多的病原檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種草魚呼腸孤病毒的三重PCR檢測引物組

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有上述引物組的草魚呼腸孤病毒三重PCR檢測試劑盒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種草魚呼腸孤病毒的三重PCR檢測方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

草魚呼腸孤病毒的三重PCR檢測引物組，由以下3對引物組成：

引物對1

P01-F：5'?GCC?ACC?TTT?GAG?CGC?GAG?AC?3'(SEQ?ID?NO：1)；

P01-R：5'?GTT?AGG?GCG?GAA?AGC?ATA?CCA?GA?3'(SEQ?ID?NO：2)；

引物對2

P02-F：5'?GCT?GAT?GCT?GCA?GAC?GGC?TAA?AC?3'(SEQ?ID?NO：3)；

P02-R：5'?TAA?TTG?CCT?GCT?GCG?CTG?ACT?3'(SEQ?ID?NO：4)；

引物對3

P03-F：5'?GGC?GGC?ATG?AAT?ATG?TAT?CGA?CT?3'(SEQ?ID?NO：5)；

P03-R：5'?TAT?GTG?ATT?ACG?CGG?GTC?AG?3'?(SEQ?ID?NO：6)。

草魚呼腸孤病毒的三重PCR檢測試劑盒，包括引物液、Tap?DNA聚合酶、PCR?buffer、dNTP混合物，所述引物液含有上述的引物組（SEQ?ID?NO1~6）。