[發明專利]一種防治根瘤線蟲的菌株培養液及其制備方法

無效

• 申請號: 201210038626.2
• 申請日: 2012-02-21
• 公開（公告）號: CN102533613A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 金泰完;金孝炫;南旭浩
• 申請（專利權）人: 沈陽麥克斯生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P5/00;C12R1/01
• 代理公司: 沈陽優普達知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 21234
• 代理人: 俞魯江

技術領域：

本發明涉及一種生物制劑及其制備方法，更具體地說，是涉及一種防治根瘤線蟲的菌株培養液及其制備方法。

背景技術：

全世界廣泛分布的對農作物產生傷害的植物寄生線蟲就是根瘤線蟲，對植物地上部分產生傷害或在土壤中棲息的同時對植物的根部進行傷害，特別是在國內，紅薯根瘤線蟲(Meloidogyne?incognita)、花生根瘤線蟲(Meloidogyne?arenaria)、胡蘿卜根瘤線蟲(Meloidogyne?hapla)等作為對作物產生傷害的主要害蟲被人們所熟知。

現階段，根瘤線蟲的防治方法有栽培防治、物理防治和化學防治。栽培防治中有新鮮水、休耕、干土、深耕、客土、水稻輪作栽培、抗病品種等，物理防治有熱處理(蒸汽、干熱、溫湯浸法)、太陽能消毒等被使用著，化學防治有噻唑磷(線蟲炭)等噴灑化學藥劑來防治著線蟲。栽培防治根據地區條件和栽培作物不同，有應用難和高費用的缺點，特別是抗病品種對作物有局限性，所以實用性很低。化學藥劑的情況，防治效果高，但大部分為有機磷劑和氨基甲酸酯類在土壤中有殘留時，毒性高，不只對環境有污染，對作物賴以生存的土壤中的有益微生物無分別的發揮殺菌作用，使得蟲害加劇，是土壤變貧瘠的原因。

作為化學防治劑的代行方案，這種利用根瘤線蟲天敵微生物，生化學劑和植物提取物的生物學方面的防治，它的研究活躍地進行中，到現在為止，已報告了的殺蟲霉(Monacroporium?thaumasium)在實際設施栽培地里使用效果極不好，對農家可普及的實用化也很艱難，還有，利用藥用植物達到殺線蟲效果的值得期待的研究也正在進行中，原料的收集很難，缺點就是還需依靠進口。

發明內容：

本發明就是針對上述問題，提供了一種防蟲效果好、環保型的防治根瘤線蟲的菌株培養液及其制備方法。

為了實現本發明的上述目的，本發明采用如下技術方案，其主要組成為名稱為Photorhabdus?temperata.subsp.Temperate的菌株。

昆蟲病原性線蟲(Heterorhabditis?bacteriophora)先后經過粉碎、分離、接種培養、提取后得到所述的菌株培養液。

具體的制備步驟為，

(1)粉碎、分離

將昆蟲病原性線蟲(Heterorhabditis?bacteriophora)置于含鏈霉素0.06wt％的NaClO溶液中進行30～40min的消毒，每500～800只昆蟲病原性線蟲用300ppm的上述NaClO溶液；

消毒后用勻漿機將線蟲全部磨碎，磨碎后的漿液置于瓊脂培養基(MacConkey?agar)中，將發出粉紅色熒光的這部分細菌取出，置于NBTA培養基中進行二次分離，最后將圍繞群體白帶的綠色群體取出備用；

昆蟲病原性線蟲購自韓國慶尚南道晉州市國立慶尚大學。

(2)接種培養

將步驟(1)得到的菌種按2.0％的接種量接種到5wt％的YS培養基中，在25～35℃、250～350rpm的條件下培養3～5天，然后將培養基中的紅色群體取出備用；

(3)提取

向步驟(2)得到的群體中加入2倍體積的2-異丙醇，用超聲波處理1-2小時，在4℃下放置24小時，除去培養液其它多糖類物質；

接著將培養液置于離心分離機中，以12,000xg進行40分鐘的離心分離，以GF/F濾紙(Whatman，直徑孔徑0.7μm)濾去細胞后即得所述的菌株培養液。

步驟(1)中所述的瓊脂培養基的組成及配比為，1L蒸餾水中，含蛋白胨17g，蛋白間質蛋白胨3g，乳糖酶10g，氯化鈉5g，膽汁酸鹽1.5g，細菌用瓊脂13.5g，中性紅0.03g，結晶紫0.001g；

NBTA培養基的組成及配比為，1L蒸餾水中，含牛肉膏3g，蛋白胨5g，細菌營養用瓊脂15g，溴麝香草酚藍0.025g，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)0.04g。

步驟(2)中的YS培養基的原料為食用油，卵黃粉，膽固醇，豬油，卵磷脂，全脂粉乳，氯化鈉，磷酸二氫鉀、酵母提取物中的一種以上。

步驟(3)中的2-異丙醇的溫度為0～5℃。

本發明的有益效果：

本發明是以名稱為Photorhabdus?temperata.subsp.Temperate的菌株為主要成分的生物制劑，替代了現存的化學農藥制劑。不只可以減少關于土壤的農藥殘留傷害，還因為土生菌種能生產殺線蟲的物質，使用含有這種成分的培養液可以減輕根瘤線蟲的傷害。