[發(fā)明專(zhuān)利]離子液體中修飾纖維素酶原位降解纖維素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210035994.1
• 申請(qǐng)日: 2012-02-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102586362A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于世濤;李露;劉仕偉;劉福勝;解從霞;謝娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P19/14
• 分類(lèi)號(hào): C12P19/14;C12N9/42
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種在氯化1-丁基-3-甲基咪唑鹽離子液體/纖維素均相體系下，聚乙二醇衍生物修飾纖維素酶原位酶解纖維素的方法。

背景技術(shù)

纖維素是世界上最豐富的可再生資源，也是解決人類(lèi)面臨的糧食問(wèn)題、能源問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題的最有前景的資源，現(xiàn)實(shí)生活中纖維素材料只有一小部分被用于紡織、造紙、建筑、飼料等方面，這不僅造成了資源的浪費(fèi)而且還引發(fā)環(huán)境問(wèn)題。將纖維素酶解為葡萄糖，再通過(guò)發(fā)酵工藝可以生產(chǎn)乙醇、丙酮、丁醇等燃料和化工原料，是纖維素綜合利用的有效途徑。但是纖維素酶水解纖維素成葡萄糖的反應(yīng)速度緩慢，在很大程度上是由于纖維素的高度結(jié)晶結(jié)構(gòu)以致纖維素酶的吸附不到位。所以這種方法要求將纖維素溶解在一定的溶劑中，破壞纖維的晶態(tài)結(jié)構(gòu)，以保證纖維素酶能夠進(jìn)入纖維素底物內(nèi)部發(fā)揮作用。

離子液體(ILs)，是一類(lèi)新型的纖維素的優(yōu)良溶劑，也是一種新型的生物催化反應(yīng)介質(zhì)。Rogers等首先發(fā)現(xiàn)離子液體氯化1-丁基-3-甲基咪唑鹽([Bmim]Cl)在室溫可以直接溶解纖維素，破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，在提高酶水解速度和降低酶用量等方面顯示了巨大潛力。隨后氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑鹽([Amim]Cl)、氯化1-(2-羥乙基)-3-甲基咪唑鹽([HeEim]Cl)等相繼被證實(shí)能夠溶解纖維素(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利CN1491974)。但此類(lèi)離子液體含有鹵素對(duì)纖維素酶活性起到抑制作用。為了保持甚至提高離子液體體系中纖維素酶的活性，就要不斷改進(jìn)離子液體，使之既能滿(mǎn)足纖維素的溶解性又能與纖維素酶的活性相匹配，咸漠等(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利CN101899487A)提出了咪唑磷酸酯類(lèi)離子液體中可以進(jìn)行纖維素酶的原位酶解。但該類(lèi)離子液體對(duì)纖維素的溶解性遠(yuǎn)不如[Bmim]Cl離子液體。因此，創(chuàng)制在[Bmim]Cl離子液體中具有高活性高穩(wěn)定性的纖維素酶是實(shí)現(xiàn)離子液體下纖維素原位酶解的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是創(chuàng)制具有高活性高穩(wěn)定性的纖維素酶，以實(shí)現(xiàn)在氯化1-丁基-3-甲基咪唑鹽([Bmim]Cl)離子液體體系下纖維素的原位酶解。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：在50-60℃下將微晶纖維素，加入到[Bmim]Cl離子液體中，得到均相溶液，纖維素占離子液體的重量比5-10％。在50-60℃下加入pH為4.8的檸檬酸緩沖液和修飾纖維素酶，檸檬酸緩沖液的加入量為離子液體質(zhì)量的5-6倍，修飾纖維素酶的加入量為每毫升離子液體0.5-5mg，反應(yīng)30分鐘至1小時(shí)，纖維素轉(zhuǎn)化成還原糖的轉(zhuǎn)化率在80-90％。

本發(fā)明采用的修飾纖維素酶是這樣得到的：在30-35℃下，在檸檬酸緩沖溶液(pH＝4.8)中，加入天然纖維素酶，待其完全溶解后，緩慢加入等質(zhì)量的聚乙二醇衍生物，混合均勻后，加入聚乙二醇衍生物質(zhì)量的30-50％的還原劑氰基硼氫鈉(NaCNBH₃)，恒溫反應(yīng)24小時(shí)，然后加入天然纖維素酶質(zhì)量20倍的甘氨酸，終止反應(yīng)，通過(guò)透析純化得到修飾纖維素酶。

本發(fā)明采用聚乙二醇衍生物為修飾劑，具體為單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量分別為5000，10000，20000，分別標(biāo)記為mPEG-ALD?5k，mPEG-ALD?10k，mPEG-ALD?20k；單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺，分子量為5000，標(biāo)記為mPEG-SPA?5k；單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺，分子量為5000，標(biāo)記為mPEG-MAL?5k。

本發(fā)明采用的纖維素酶，酶活力：1800u/毫克，pH范圍：pH2.5-7.5最佳：pH?4.8，溫度范圍：30-80℃最佳溫度50℃。

本發(fā)明采用微晶纖維素原料的分子量2.5～5萬(wàn)，聚合度153～300，灰分＜0.6％，粒徑25～190μm。

發(fā)明效果

本發(fā)明提供的新型纖維素酶，能在含有鹵素的離子液體中表現(xiàn)出良好的活性和穩(wěn)定性，很好地促進(jìn)纖維素降解。使用本發(fā)明的方法可提高天然纖維素酶抵制環(huán)境引起酶失活的能力，從而提高了酶的催化活性，在反應(yīng)過(guò)程中始終保持較高的催化活性，具有明顯的先進(jìn)性，將為纖維素資源的綜合利用提供一條新的途徑。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，并非限制本發(fā)明所涉及的范圍。

實(shí)施例1：

微晶纖維素原料：分子量2.5～5萬(wàn)，聚合度153～300，灰分＜0.6％，粒徑25～190μm。

還原糖量的測(cè)定方法