[發明專利]一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產量的方法

有效

• 申請號: 201210035298.0
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN102533701A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 吳敬;陳晟;段緒果;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/44
• 分類號: C12N9/44;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種淀粉脫支酶的發酵生產方法，特別是一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高重組淀粉脫支酶胞外分泌的發酵生產方法。

背景技術

淀粉脫支酶(E.C.3.2.1.41)是一類能夠水解支鏈淀粉、α-極限糊精等分子中α-1，6葡萄糖苷鍵的淀粉水解酶。淀粉脫支酶通常和其它淀粉酶復配用于生產葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產品。淀粉脫支酶可以切斷淀粉中的分支點，加速后續酶的反應，縮短反應時間，提高淀粉的轉化率，降低其它糖化用酶制劑的使用量，從而達到增加產量、提高設備利用率、降低生產成本的目的。目前能夠在最適溫度和最適pH上同時實現與糖化酶進行較好配合的商品化淀粉脫支酶主要是美國杰能科公司的Optimax?L-1000。我國雖然對淀粉脫支酶進行了大量的研究，但是還沒有實現該酶的工業化生產，還需要依賴進口。

近年來國內外學者把淀粉脫支酶的開發研究作為非常重要的研究主題。Bunzo?Mikami等對來源于Klebsiella?pneumoniae的淀粉脫支酶蛋白晶體結構進行解析，發現該酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)₈桶狀結構。近年來國外學者從極端嗜熱微生物中分離出具有可以耐受接近100℃高溫的淀粉脫支酶，但是這些酶往往只有在pH?6.0以上才具有較高的活性。R?Koch等從Fervidobacterium?pennavorans中分離到最適pH在4.5到5.0，而且能夠在70℃條件下具有較高穩定性的淀粉脫支酶。國內主要研究了產淀粉脫支酶野生菌的篩選鑒定、重組菌構建、發酵條件優化以及在淀粉原料酶解中的應用。唐寶英等人從土壤中分離出一株產淀粉脫支酶芽孢桿菌，通過誘變和產酶條件優化，酶活從1.6U/mL提高到8.8U/mL，該酶最適反應溫度和pH分別為75℃和4.6，在55℃反應條件下，在pH4.0-8.0范圍內活性穩定。張明炎等將來源于地衣芽孢桿菌的淀粉脫支酶編碼基因克隆大腸桿菌中進行表達，搖瓶發酵產酶最高達到6.5U/mL。蘇喆等實現了來源于Thermotoga?maritima的淀粉脫支酶編碼基因在枯草芽孢桿菌中的成功表達，該酶最適溫度90℃，最適pH?6.0，發酵酶活可達89.1U/mL。但是這些菌株的產酶水平仍然較低，生產成本高。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產量的方法，以解決現有發酵工藝中胞外酶活較低、生產成本高、無法實現工業化生產的問題。為解決上述問題，本發明的技術方案如下：

(1)重組菌構建

根據NCBI上登錄的pulB的基因序列(Genbank號JN872757.1)，采用化學全合成方法合成淀粉脫支酶基因序列pulB。用于構建大腸桿菌表達載體的質粒是pET20b(+)，帶有T7啟動子。將pET20b(+)質粒和含有pulB基因的質粒分別進行Nco?I和HindIII雙酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶連接，連接產物轉化E.coli?JM109感受態細胞，經37℃培養8h，挑轉化子在含有100mg/L氨芐青霉素液體的LB中振蕩培養，提取質粒，酶切驗證得到表達質粒pulB/pET20b(+)。

將質粒pulB/pET20b(+)轉化E.coli?BL21(DE3)宿主菌，涂布含氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板上，37℃培養8h，命名為pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)。挑單菌落至液體LB中，37℃培養過夜，保存甘油管。

(2)種子制備

將-80℃甘油管保存的菌株接入種子培養基中，使用回轉恒溫調速搖床進行培養，控制轉速200rpm/min，培養溫度37℃，初始pH值7.10，培養時間10小時。

(3)發酵工藝

將活化后的種子培養液接種入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持20-30％，控制溫度為30±1℃，流加質量濃度為25％的氨水控制pH?7.0±0.5，培養5-6小時；

待溶氧上升至80-100％，以指數流加的方式補加補料液使溶氧維持在20-30％，溫度維持在30±1℃，流加氨水控制pH?7.0±0.5，當菌體OD₆₀₀達到15-30時補加0.75-1.5％(m/V)的甘氨酸；