[發明專利]血清中PCDH10的TRFIA法檢測用試劑盒

無效

• 申請號: 201210034733.8
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN102590529A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 邵偉
• 申請（專利權）人: 邵偉
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 舟山固浚專利事務所 33106
• 代理人: 范榮新

技術領域

本發明涉及一種血清中PCDH10的TRFIA法檢測用試劑盒，涉及PCDH10蛋白C-端和N-端的特異性多肽片段的兩種特異抗體的制備，并利用所制備的雙抗體，采用時間分辨熒光免疫法(TRFIA)檢測血清樣品中PCDH10方法。屬于PCDH10蛋白的抗體制備和時間分辨熒光免疫(TRFIA)分析領域。

背景技術

PCDH10是一個新的腫瘤抑制基因，PCDH10蛋白在血清中的顯著降低對一些腫瘤(如大腸癌等)有提示作用。PCDH10是屬于Ca²⁺依賴性鈣粘蛋白家族的一員，具有6個重復串聯的胞外區和1個獨特的胞內區。浙江大學朱永良等人在對原代腫瘤干細胞基因表達譜時用病毒文庫技術篩選時發現pcdh10^-/-細胞易游出和穿過“Transwell”的半透膜，而pcdh10^+/+的細胞遷移性較弱。通過生物信息學分析，進一步克隆了pcdh10的全長cDNA序列并構建了表達pcdh10的真核細胞表達載體，通過脂質體瞬時轉染k562細胞、SW480大腸癌細胞發現異位表達PCDH10抑制了這些細胞在體外的增殖，并增加了細胞的凋亡。進一步發現對這些細進行無血清饑餓和添加化療藥物等處理后PCDH10表達水平隨時間和濃度的增加而增加，提示PCDH10參與了細胞凋亡，可能是一個腫瘤抑制基因。然對其參與細胞凋亡的分子機制尚不明了。

浙江大學朱永良等人的發明專利“針對PCDH10C-端蛋白片段分子的特異性抗體的制備方法”(專利號為ZL200810060201)中，利用了PCR技術從體外培養細胞中克隆了PCDH10蛋白的C-端DNA序列并轉化入原核細胞中進行表達，獲得了純化的PCDH10C-端多肽，并免疫大白兔，收集并純化大白兔的抗血清，純化后獲得了PCDH10蛋白C-端多肽的抗體。但尚未發現針對PCDH10蛋白N-端多肽的特異性抗體。所述針對PCDH10C端蛋白片段分子的特異性抗體的制備方法的具體步驟是：“1)采用聚合酶鏈式反應技術直接從體外培養細胞株中將PCDH10C?3’端堿基序列克隆至原核細胞，構建PCDH10C端融合蛋白的原核細胞PCDH10C/pETl5b表達載體；2)將PCDH10C/pETl5b表達載體轉化BL21?DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核細胞表達系統，用His金屬螯和樹脂純化PCDH10C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10C端融合蛋白N端的His-tag標簽，得到PCDH10C端融合蛋白；3)用己切除標簽的PCDH10C端融合蛋白作為抗原免疫大白兔，產生抗PCDH10C端抗體，收集抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、Protein?A-Sepharose親和柱純化兔抗PCDH10C端抗體。”

目前市面上尚未有商品試劑盒用于檢測該蛋白，所以發明一種簡單而高靈敏度的方法來測定血清中PCDH10蛋白含量以評價患癌癥的幾率，意義非常重大。

時間分辨熒光免疫分析是自上個世紀70年代末80年代初，新發展起來的一項免疫分析方法，它克服了利用熒光素進行熒光免疫分析時背景干擾嚴重的影響。TRFIA原理是利用具有雙功能基團結構的螯合劑，一般采用BHHCT(4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-酰基)-氯磺化鄰三聯苯)，其一端與鑭系元素結合，另一端與抗體(蛋白質)分子中的自由氨基結合，制成鑭系元素標記的(一般用Eu³⁺標記)抗體。它與待定抗原結合為免疫復合物。理想情況下，測定復合物中Eu³⁺的熒光強度就能確定樣品中抗原的量，但是實際上這種復合物種鑭系元素的熒光強度非常弱，只有加入一種增強液，使鑭系元素從復合物中解離下來，并與增強液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NAT)重新形成微膠囊，在紫外等光的激發下發射很強的熒光，增強效果上百萬倍。用時光分辨熒光儀測定熒光強度cps，即可確定樣品抗原中的量。