[發明專利]血清中PCDH10的TRFIA法檢測用試劑盒

無效

• 申請號: 201210034733.8
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN102590529A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 邵偉
• 申請（專利權）人: 邵偉
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 舟山固浚專利事務所 33106
• 代理人: 范榮新

1.一種血清PCDH10的TRFIA法檢測用試劑盒，具有能與PCDH10C-端融合蛋白結合并被Eu³⁺絡合物標記的第二抗體凍干品；該第二抗體凍干品是經1)以聚合酶鏈式反應將PCDH10C?3’端堿基序列克隆至原核細胞，構建PCDH10C端融合蛋白的原核細胞表達載體；2)將表達載體轉化BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核細胞表達系統，用His金屬螯和樹脂純化PCDH10C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10C端融合蛋白N端的His-tag標簽，得到PCDH10C端融合蛋白；3)用己切除標簽的PCDH10C端融合蛋白作為抗原免疫大白兔，產生抗PCDH10C端抗體，收集抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、Protein?A-Sepharose親和柱純化所得；其特征是：還有包被有具有固相結合部分及能與PCDH10N-端融合蛋白結合的第一抗體的多孔型微量滴度板。

2.權利要求書1所述的試劑盒，其特征是：其中第一抗體為PCDH10N-端融合蛋白的動物抗體；其中第二抗體為PCDH10C-端融合蛋白的動物抗體。

3.權利要求書1所述的試劑盒，其特征是：此檢測試劑盒還包括PCDH10標準蛋白凍干品、洗滌液、優選牛血清BSA和增強液。

4.權利要求書1所述的試劑盒，其特征是：其中包被有具有固相結合部分及能與PCDH10N-端融合蛋白結合的第一抗體的制備方法為：

(a)采用聚合酶鏈式反應技術直接從體外培養細胞株中將PCDH10N?3’端堿基序列克隆至原核細胞，構建PCDH10N-端融合蛋白的原核細胞PCDH10N/PET32a表達載體。其特征是在經逆轉錄酶轉錄mRNA獲得的cDNA兩端設計上游包含BamH?I酶切位點之引物和下游包含Hind?III酶切位點之引物的cDNA片段經高溫多聚酶鏈式反應擴增為含BamH?I和Hind?III位點的雙鏈DNA?PCDH10N-端基因，然后克隆入PET32a載體的BamH?I/HindⅢ位點；

構建PCDH10N-端融合蛋白的具體方法是：將表達PCDH10的1×10⁵～10⁷人白血病K562細胞離心沉淀，加入0.5～1.5ml?Trizol充分混勻，提取總RNA，再用逆轉錄酶轉錄RNA至cDNA；然后設計上游引物包含BamH?I內切酶位點GGATCC和下游引物包含Hind?III內切酶位點AAGCTT，通過PCR的方?法直接將PCDH10N-端DNA序列克隆至PET32a?BamH?I/Hind?III位點，經BamH?I和Hind?III內切酶酶切鑒定合格后，進一步用DNA測序驗證，合格即為PCDH10N/PET32a表達載體；

(b)將PCDH10N/PET32a表達載體轉化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核細胞表達系統，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10N-端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10N-端融合蛋白N-端的His-tag標簽，得到PCDH10N端融合蛋白；

所述的將PCDH10N/PET32a表達載體轉化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核細胞表達系統，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10N-端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10N-端融合蛋白N端的His-tag標簽包括如下步驟：

(1)取1～3μl鑒定合格的PCDH10N/PET32a重組質粒加至10～90μl感受態的BL21DE3pLysS大腸桿菌，冰浴15～45min，42℃60s休克，加入50～350μl?LB液30～44℃30～90min，涂布含50～150μg/ml的LB平板，37℃孵箱培養過夜，次日，用滅菌牙簽挑取單個菌落于一管6～8ml新的LB液中，至37℃孵箱靜置過夜，取OD為0.4～0.6的過夜菌液300～1000μl于一管6～8ml新的LB液中，30～44℃擴大培養2～8h，加入終濃度為1～7mM的IPTG誘導0.5～6h，離心收集細菌沉淀；

將細菌沉淀以每克濕重細菌加入1～5ml?pH6～8，含0.5～1.5％Trition，0.02～0.08M的磷酸鹽緩沖液，重懸細菌，冰浴下超聲粉碎細菌，高速冷凍離心區上清液，沉淀繼續超聲粉碎，高速冷凍離心，合并上清液，上His金屬螯合樹脂柱，用含5mM咪唑的pH6～8，0.02～0.08M的磷酸鹽緩沖液充分洗柱，用5％的柳硫汞檢測至無蛋白流出為止，改用含500mM咪唑，pH6～8，0.02～0.08M的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集流出的蛋白液，裝入透析袋，2～8℃對pH6～8、0.005～0.015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3～12h換液1次，共3～9次；在透析平衡結束后，用MW10000～30000的聚乙二醇濃縮至0.5～1.5mg/ml，取5～10mg重組蛋白用Thrombin酶切除N-端的His-tag標簽，同時通過加入Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到純化的PCDH10N-端重組蛋白，該蛋白用SDS-PAGE電泳時，5～20μg/lane應無雜蛋白區帶發現。

(c)用已切除標簽的PCDH10N-端融合蛋白作為抗原免疫動物，產生抗?PCDH10N-端抗體；具體包括如下步驟：

(1)分別取1mg的PCDH10N端重組蛋白與完全福氏佐劑混勻，充分乳化，接種動物皮下3～20余點，每隔5～12天強化免疫1次，待第3～4周末，用0.5～1.5mg?PCDH10N端重組蛋白進行直接的兔耳靜脈內注射，5～7天后分離動物頸總動脈，剪短放血至三角燒瓶，2～8℃傾斜放置過夜，次日離心收集血清；

(2)將收集的抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗PCDH10N-端抗體的方法是：將收集的兔血清用2～6倍預冷的0.005～0.03M，pH?6～8PBS稀釋，在不斷攪拌的同時緩慢加入1～2倍體積的飽和(NH₄)₂SO₄，2～8℃放置20～30min，離心，去上清，沉淀用0.5～2倍原體積的PBS復溶后，再分別用50％和33.3％的飽和(NH₄)₂SO₄重復沉淀各1次，最后蛋白沉淀用2～3ml?PBS復溶后，裝入透析袋，2～8℃對0.005～0.03M，pH?6～8PBS透析除鹽，每隔3～12h換液1次，加至預經0.01M，pH?6～8PBS平衡的ProteinA-Sepharose柱，流速0.5ml/min，流盡后，用0.02～0.08M，pH?6～8的磷酸鹽緩沖液充分洗至無蛋白流出為止，改用3M，pH?6～8硫氰酸鈉洗脫結合的IgG，合并洗脫液，2～8℃對pH?6～8、0.005～0.015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3～12h換液1次，共3～9次，用MW10000～30000的聚乙二醇濃縮至0.5～1.5mg/ml，分裝，-20℃保存。