[發(fā)明專利]一種包含自剪切位點(diǎn)的組織特異性雙基因沉默RNAi表達(dá)載體

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210033935.0
• 申請(qǐng)日: 2012-02-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533831A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任雪玲;張振中;柴麗娜;宋雨;張?jiān)?/a>
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/66;C12N15/86
• 代理公司: 鄭州天陽(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 41113
• 代理人: 宋金鼎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種包含自剪切位點(diǎn)的組織特異性雙基因沉默RNAi表達(dá)載體。

背景技術(shù)

核糖核酸干擾(RNA?interference，RNAi)是指具有特定序列的小RNA雙鏈(short?interfering?RNA，siRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞后通過(guò)誘導(dǎo)同源信使核糖核酸(messenger?RNA，mRNA)降解，導(dǎo)致特定基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象(Fire?et?al，Nature?1998391：806)。siRNA是具有兩個(gè)堿基冗余的3’羥基末端的核糖核酸(ribonucleic?acid，RNA)雙鏈分子，該分子能與沉默復(fù)合物結(jié)合并對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割。切割通常發(fā)生在siRNA同源部分的中間，離siRNA反義鏈5’端10個(gè)堿基處。siRNA不僅易被環(huán)境中廣泛存在的RNA酶降解，而且具有穩(wěn)定性差、抑制作用短暫、不能遺傳、成本高等缺點(diǎn)(Emily?et?al，Methods?in?Molecular?Biology?2008442：45)。因此，研究者發(fā)展了由RNA聚合酶(RNA?polymerase，Pol)在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄來(lái)獲得siRNA的方法，該方法通常由短發(fā)夾RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)產(chǎn)生(Paddison?et?al，Genes?&?Development?2002?16：948)。shRNA是由一條RNA單鏈經(jīng)自身折疊而成，包括兩個(gè)短的反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)(loop)序列分隔的，組成類似發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。shRNA由表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄得到，可以模仿siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，能夠在體內(nèi)、體外有效抑制靶基因mRNA的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)RNAi效應(yīng)。由于shRNA具有可遺傳、成本低廉，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此已成為研究基因功能的重要工具，并在腫瘤基因治療、遺傳病研究等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

目前，shRNA表達(dá)載體通常是由RNA聚合酶III(Pol?III)啟動(dòng)子調(diào)控的，例如H1、U6啟動(dòng)子。Pol?III啟動(dòng)子具有明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(TTTTTT)，可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效而穩(wěn)定的基因沉默。但是Pol?III啟動(dòng)子缺乏組織特異性，其調(diào)控產(chǎn)生的RNAi效應(yīng)也缺乏組織特異性。組織特異性Pol?II啟動(dòng)子會(huì)調(diào)控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在特定組織細(xì)胞及器官內(nèi)的表達(dá)。例如，前列腺特異抗原(PSA)啟動(dòng)子可以使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只在前列腺細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Zhao?et?al，Seminars?and?Original?Investigations?200927：539)，載脂蛋白A-I(apolipoprotein?A-I，apoA-I)啟動(dòng)子具有肝組織特異性(任雪玲等，中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志200922：3403)，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Human?telomerase?reverse?transcnptase，hTERT)啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，而在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)是沉默的(Takeda?et?al，The?Journal?of?Clinical?Endocrinology?&?Metabolism?200888：3531)等等。因此，利用Pol?II啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)shRNA的組織特異性轉(zhuǎn)錄是解決RNAi效應(yīng)組織特異性問(wèn)題的有效策略。

Pol?II啟動(dòng)子可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的組織特異性，但其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制與Pol?III啟動(dòng)子明顯不同。首先，Pol?II啟動(dòng)子沒(méi)有明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，而且一旦轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，新生成的mRNA會(huì)在5’端加上倒轉(zhuǎn)的鳥(niǎo)核苷酸三磷酸，并通過(guò)進(jìn)一步的甲基化作用而產(chǎn)生m⁷G帽子結(jié)構(gòu)。其次，Pol?II啟動(dòng)子也沒(méi)有明確的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，其轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在成熟轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端下游幾千堿基之后。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)內(nèi)切及進(jìn)一步的多腺苷酸化作用，在3’末端加上數(shù)量不等的腺嘌呤，形成多聚腺嘌呤(polyA)的尾巴。Pol?II啟動(dòng)子調(diào)控機(jī)制中的5’端m⁷G帽子結(jié)構(gòu)和3’端poly?A尾巴對(duì)于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的功能非常重要，不僅是影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物穩(wěn)定性的主要因素之一，同時(shí)也促進(jìn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物迅速通過(guò)核孔進(jìn)入胞漿。當(dāng)Pol?II啟動(dòng)子調(diào)控產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是shRNA時(shí)，shRNA迅速、不斷進(jìn)入胞漿中將會(huì)造成RNAi效應(yīng)的不確定性，例如脫靶效應(yīng)。因此，有效去除Pol?II啟動(dòng)子調(diào)控產(chǎn)生的shRNA結(jié)構(gòu)上的5’端m⁷G帽子和3’端poly?A尾巴對(duì)于誘導(dǎo)有效及穩(wěn)定的RNAi效應(yīng)至關(guān)重要。