[發(fā)明專利]一種包含自剪切位點的組織特異性雙基因沉默RNAi表達載體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210033935.0
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN102533831A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設計）人: 任雪玲;張振中;柴麗娜;宋雨;張云
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/86
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 宋金鼎

1.一種包含自剪切位點的組織特異性雙基因沉默RNAi表達載體，其特征在于，該載體含有一個組織特異性雙基因沉默shRNA表達框，所述的該表達框包含：一個插入組織特異性啟動子的多克隆位點、兩個含有自剪切位點的核酶序列、兩個插入shRNA模板序列的多克隆位點和一個轉(zhuǎn)錄終止序列；所述的插入組織特異性啟動子的多克隆位點位于兩個含有自剪切位點的核酶序列中的第一個含有自剪切位點的核酶序列上游；所述的轉(zhuǎn)錄終止序列位于兩個含有自剪切位點的核酶序列中的第二個含有自剪切位點的核酶序列下游；所述的兩個插入shRNA模板序列的多克隆位點中的第一個插入shRNA模板序列的多克隆位點位于兩個含有自剪切位點的核酶序列之間，第二個插入shRNA模板序列的多克隆位點位于第二個含有自剪切位點的核酶序列與轉(zhuǎn)錄終止序列之間；

包含自剪切位點的組織特異性雙基因沉默RNAi表達載體的構(gòu)建，由以下步驟實現(xiàn)：

(1)在第一個自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分別添加和初始載體的限制性內(nèi)切酶II和III的酶切位點相同的酶切位點，人工合成，得第一個具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性內(nèi)切酶II和III雙酶切，插入至初始載體相同的酶切位點，采用常規(guī)方法構(gòu)建含有第一個自剪切核酶序列的載體A，所述的第一個自剪切核酶序列上含有一個自剪切位點，載體A上相應也含有第一個自剪切位點，初始載體為可插入外源核酸片段、能攜帶外源核酸進入哺乳動物細胞，并在其中進行獨立和穩(wěn)定的自我復制的核酸分子；

(2)在第二個自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分別添加和載體A的第一個自剪切核酶序列下游的限制性內(nèi)切酶IV和V的酶切位點相同的酶切位點，人工合成，得第二個具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性內(nèi)切酶IV和V雙酶切，插入至載體A相同的酶切位點，采用常規(guī)方法構(gòu)建含有第一個自剪切核酶序列和第二個自剪切核酶序列共兩個自剪切核酶序列的載體B，所述的第二個自剪切核酶序列上含有一個自剪切位點，因此載體B上相應含有第一個自剪切位點和第二個自剪切位點共兩個自剪切位點；

(3)在轉(zhuǎn)錄終止序列的5’末端和3’末端分別添加和載體B的第二個自剪切核酶序列下游的限制性內(nèi)切酶VI和VII的酶切位點相同的酶切位點，人工合成，得具有轉(zhuǎn)錄終止序列的寡核苷酸，用限制性內(nèi)切酶VI和VII雙酶切，插入至載體B相同的酶切位點，采用常規(guī)方法構(gòu)建含有第一個自剪切核酶序列和第二個自剪切核酶序列共兩個自剪切核酶序列以及一個轉(zhuǎn)錄終止序列的載體C，即為含有一個組織特異性雙基因沉默shRNA表達框的包含自剪切位點的組織特異性雙基因沉默RNAi表達載體，所述載體C的限制性內(nèi)切酶II酶切位點上游具有限制性內(nèi)切酶I酶切位點，限制性內(nèi)切酶I和II酶切位點作為插入組織特異性啟動子的多克隆位點，限制性內(nèi)切酶III和IV酶切位點作為第一個插入shRNA模板序列的多克隆位點，限制性內(nèi)切酶V和VI酶切位點作為第二個插入shRNA模板序列的多克隆位點；

所述的組織特異性啟動子是具有組織特異性的RNA聚合酶II啟動子，包括具有腫瘤組織特異性的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子SEQ?ID?NO：25或具有肝組織特異性的載脂蛋白A-I啟動子SEQID?NO：24；所述的自剪切位點是自剪切核酶序列中發(fā)生自我剪切作用的位點，自剪切核酶序列包括順式作用無勾雙髻鯊核酶序列SEQ?ID?NO：1；所述的轉(zhuǎn)錄終止序列是可以終止DNA轉(zhuǎn)錄的序列，包括鋅指蛋白MAZ結(jié)合序列SEQ?ID?NO：2；所述的兩個shRNA模板序列是指經(jīng)轉(zhuǎn)錄可以得到shRNA，并誘導靶基因發(fā)生RNAi效應的序列，包括靶向人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的shRNA模板序列SEQ?ID?NO：3、靶向人表皮生長因子受體的shRNA模板序列SEQ?ID?NO：5、靶向細胞原癌基因c-fos的shRNA模板序列SEQ?ID?NO：6、靶向原癌基因JunB的shRNA模板序列SEQ?ID?NO：4中的任何兩個。