[發明專利]以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建

無效

• 申請號: 201210033514.8
• 申請日: 2012-02-15
• 公開（公告）號: CN102586314A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 白楊;龍北國;范宏英
• 申請（專利權）人: 白楊;龍北國;范宏英
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/64;C12N15/65
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉媖

技術領域

?本發明涉及一種乳酸菌表達質粒的構建，特別是一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建，屬于生物技術領域。

背景技術

目前乳酸菌表達載體應用較多的是質粒pMG36e，為組成型表達載體，由強啟動子p32及其下游的部分開放閱讀框、多克隆位點和來自乳酸乳菌乳脂亞種蛋白酶基因（prtP）的轉錄終止子、以及pWV01復制子和來自于質粒pE194的紅毒素抗性基因Emr構成，質粒大小為3.6kb。該質粒便于宿主攜帶，可組成型表達外源目的基因。目前已在乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等中成功表達多種外源基因。但由于該質粒以紅霉素抗性基因作為篩選標志，在人體中不能以抗生素作為選擇壓力。在沒有了選擇壓力的情況下，質粒載體易丟失，從而不能實現外源抗原基因的長期穩定表達，限制了它在食品及醫藥工業方面的實際應用。因此，研發以食品級選擇標記取代抗生素抗性標記載體，構建對人體和環境安全的食品級活載體成為疫苗、食品、藥品應用研究方面的熱點。

乳酸鏈球菌素（Nisin）是由乳酸乳球菌產生的一種低聚肽，能夠抑制大多數革蘭氏陽性和陰性細菌的生長。目前已對Nisin的安全性問題進行了系統的研究。人類大腸中存在產Nisin的益生菌乳酸鏈球菌菌株，天然牛奶及乳酪和酸奶中也存在Nisin的乳酸鏈球菌菌株。Nisin廣泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中，它隨著食品被人們攝入，不改變腸道正常菌群，沒發現毒性問題，是一種安全的天然產物。FAO/WHO食品添加劑聯合專家委員會、美國FDA、我國衛生部等50多個國家及地區已批準Nisin應用于食品。因此利用Nisin為誘導物的表達調控系統，構建以Nisin為選擇標記的乳酸菌食品級質粒載體，依靠人類大腸中天然存在產Nisin的益生菌乳酸鏈球菌產生的Nisin作為選擇壓力，可以實現長期穩定表達目的抗原蛋白。

發明內容

本發明的目的是提供一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建。

為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建，是用來自乳酸菌載體pNZ9530的Nisin元件替換乳酸菌質粒pMG36e紅霉素抗性基因作為選擇標記，通過PCR擴增、基因克隆、合成多克隆位點MCS、加入嗜酸乳桿菌信號肽Ins、消除抗性基因Emr來實現Nisin食品級表達/分泌型載體PMN-5的構建。

本發明的一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建方法包括以下步驟：

（1）以pNZ9530為模板PCR擴增Nisin元件，在其2端插入酶切位點SphI與SacI；

（2）將上述步驟擴增得到的Nisin元件插入骨架載體pMG36e；

（3）PCR擴增啟動子元件Pins，于其2端加入酶切位點EaRI，并于Pins?片段中插入Hpa?I酶切位點；

（4）將步驟（3）獲得的Pins1片段插入骨架載體PMN-1中，得到載體PMN-2；

（5）合成小片段多克隆位點MCS，并插入載體PMN-2中，得到載體PMN-3；

（6）合成嗜酸乳桿菌信號肽Ins，并將其插入步驟（5）獲得載體PMN-3至多克隆位點MCS后，得到載體PMN-4；

（7）利用步驟（3）添加的Hpa?I酶切位點消除載體PMN-4的抗性基因Emr，獲得食品級表達/分泌載體PMN-5，完成以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建。

所述Nisin元件來自于人類大腸中天然存在產Nisin的益生菌乳酸鏈球菌。

本發明相對于現有技術的有益效果是：

（1）本發明的以食品級選擇標記取代了抗生素抗性標記載體，所構建出來的食品級表達/分泌載體PMN-5為食品級活載體，對人體和環境安全系數高，可廣泛應用于疫苗、食品、藥品的應用研究；

（2）本發明是依靠人類大腸中天然存在產Nisin的益生菌乳酸鏈球菌所產生的Nisin作為選擇壓力，質粒載體不易丟失，可實現外源抗原基因的長期穩定表達，實現長期穩定表達目的抗原蛋白；

（3）本發明的構建方法相較于過去繁瑣耗時的構建方法，簡化了乳酸菌表達質粒的構建方法，且該方法的可操作性強。

附圖說明

圖1?為本發明所述以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建技術路線圖。

圖2?為實施例2中基于Nisin系統的食品級重組幽門螺桿菌二價嗜酸乳桿菌活疫苗的研制路線圖。

具體實施方式