[發明專利]以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建

無效

• 申請號: 201210033514.8
• 申請日: 2012-02-15
• 公開（公告）號: CN102586314A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 白楊;龍北國;范宏英
• 申請（專利權）人: 白楊;龍北國;范宏英
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/64;C12N15/65
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉媖

1.一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建，其特征在于：是用來自乳酸菌載體pNZ9530的Nisin元件替換乳酸菌質粒pMG36e紅霉素抗性基因作為選擇標記，通過PCR擴增、基因克隆、合成多克隆位點MCS、加入嗜酸乳桿菌信號肽Ins、消除抗性基因Emr來實現Nisin食品級表達/分泌型載體PMN-5的構建。

2.一種如權利要求1所述的以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建，其特征在于：其構建方法包括以下步驟：

（1）以pNZ9530為模板PCR擴增Nisin元件，在其2端插入酶切位點SphI與SacI；

（2）將上述步驟擴增得到的Nisin元件插入骨架載體pMG36e；

（3）PCR擴增啟動子元件Pins，于其2端加入酶切位點EaRI，并于Pins?片段中插入Hpa?I酶切位點；

（4）將步驟（3）獲得的Pins1片段插入骨架載體PMN-1中，得到載體PMN-2；

（5）合成小片段多克隆位點MCS，并插入載體PMN-2中，得到載體PMN-3；

（6）合成嗜酸乳桿菌信號肽Ins，并將其插入步驟（5）獲得載體PMN-3至多克隆位點MCS后，得到載體PMN-4；

（7）利用步驟（3）添加的Hpa?I酶切位點消除載體PMN-4的抗性基因Emr，獲得食品級表達/分泌載體PMN-5，完成以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建。

3.如權利要求1或2所述的以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質粒的構建，其特征在于：所述Nisin元件來自于人類大腸中天然存在產Nisin的益生菌乳酸鏈球菌。