[發明專利]4個聾病易感基因聯合檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201210033159.4
• 申請日: 2012-02-14
• 公開（公告）號: CN102534030A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 萬戈江;魏宏泉;步訊;夏子芳
• 申請（專利權）人: 北京科聆金儀生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種同時檢測4個聾病易感基因熒光檢測試劑盒，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

世界范圍內對聽力語言殘疾者進行的致病因素研究表明，約60-80％患者的病因與遺傳因素有關，其中發達國家的臨床研究數據表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80％。因此近十幾年來，遺傳性耳聾的發病機制及其分子流行病學的研究成為了聾病研究最重要的內容之一。隨著人類基因組計劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進步，聾病的分子遺傳學研究和分子流行病學的數據使研究者們逐步認識到聾病易感基因突變在維護聽力健康和發現聽力異常中的重要性。

在目前已經定位和克隆的耳聾相關基因中，GJB2是最常見的易感基因，在先天性重度耳聾患者中約占30-50％。目前，在該基因已經發現了100多種突變類型，然而，不同種族GJB2基因常見的突變形式不同。在中國常見的突變形式為235delC，其在所有致病性突變中約占74.14％，約22.2％的中國耳聾患者與該突變有關。

藥物的耳毒性是導致語前聽力損失的一個重要因素，部分與線粒體12S?rRNA基因1555A＞G突變有關，該突變可以增加耳蝸對氨基糖甙類藥物的敏感性。在美國，耳毒性藥物相關的聽力損失患者中，10％的具有12S?rRNA基因1555A＞G突變，美國語前聽力損失患者中，1555A＞G突變患者的發病率約為1/20000-1/40000。在西班牙，12S?rRNA基因1555A＞G突變與15-20％的家族性非綜合征型聽力損失有關，許多年老的家族成員即使沒有使用氨基糖甙類藥物也可發生因此突變導致的聽力下降。而在中國，藥物性耳聾的發病率超出了原有的想象，在一系列的文章報道中，發現在門診散發的耳聾患者中，約5％的患者是由于12S?rRNA基因1555A＞G突變導致的，而在聾啞學校這樣一個特殊群體，則高達12％的患者是由于12SrRNA基因1555A＞G突變接觸氨基糖甙類藥物而致聾。同時在中國群體中還發現了12S?rRNA基因1494C＞T突變與藥物性耳聾的關系，目前至少已經發現了三個大的家系是由于1494C＞T突變導致的。1555A＞G突變和1494C＞T突變者在出生時往往聽力正常，很難通過聽力篩查而被提前發現和預測，卻存在因耳毒性藥物的使用而發生聽力損失的隱患。

SLC26A4基因與弧立的大前庭水管綜合征及Pendred綜合征(前庭水管擴大或伴內耳畸形、神經性聾和甲狀腺腫)的關系密切，臨床上表現為先天性或后天性耳聾，耳聾發生或加重與外傷、感冒有關。通過顳骨CT掃描可以得出結論，但目前由于設備和專業人員的限制，中國大部分地區的醫院不能進行高分辨率的顳骨CT掃描，導致許多地區無法診斷大前庭水管綜合征。通過對SLC26A4基因的檢測，則可以在全國范圍內實現對80％以上大前庭水管綜合征的準確診斷，并先于CT檢查發現和確診大前庭水管綜合征，這一方法可以避免放射線檢查的輻射問題，更易為患者家屬接受，并且由于基因診斷操作能夠批量進行，可以在大標本范圍內進行篩查。大量研究表明，存在于中國人群突變熱點區域為：SLC26A4基因外顯子8的側翼序列的IVS7-2A＞G。

目前常用的基因檢測方法有：直接測序(direct?sequencing，DS)、連接酶檢測反應(ligase?detection?reaction，LDR)、限制性片段長度多態性分析(restriction?fragment?length?polymorphism，RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing?high?performance?liquid?chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結果不易判讀、重復性差、假陰性假陽性多等問題。

采用熒光標記技術、毛細管電泳技術、多重PCR復合擴增，通過帶不同熒光標記物的多對引物同時對GJB2235delC、12S?rRNA?1555A＞G突變、1494C＞T突變、IVS7-2A＞G特異性的擴增，并在這些引物中摻入核酸類似物以提高引物的Tm值，進一步增強引物的特異性，而后經毛細管電泳后分析PCR產物出峰情況，即可實現對這4個耳聾基因位點的同時檢測。該方法靈敏度高、判讀清晰準確、采樣方便，并能實現一次性獲得4個關鍵位點診斷結果的高通量篩查流程，大大節約了人力物力和時間、防止多步操作而產生污染。

發明內容