[發明專利]大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210033135.9
• 申請日: 2012-02-14
• 公開（公告）號: CN102605053A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 傅詠南;張奕;王校
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術領域

本發明涉及一種大腸埃希菌(Escherichia?coli，ECO)中耐消毒劑mdfA基因攜帶情況的檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

細菌的外排泵系統可分5類：ATP結合盒轉運體家族(ATP-binding?cassette?family，ABC)、主要易化因子超家族(the?major?facilitator?superfamily，MFS)、藥物與代謝物轉運體超家族(the?much?larger?drug/metabolite?transporter?superfamily，DMT)及與之相關的小多藥外排家族(the?small?multidrug?resistance?family，SMR)、多藥物與毒物外排家族(the?multidrug?and?toxic?compound?extrusion?family，MATE)、耐受-生節-分裂家族(the?resistance-nodulation-division?family，RND)。ABC為能量泵，其余為質子泵。質子泵為細菌通過質子耦聯交換產生的質子驅動力(proton?motive?force，PMF)介導的次級藥物(化合物)轉運系統。細菌通過此類基因表達對多種化合物(含消毒劑、滅菌劑)的耐藥。mdfA編碼超廣譜外排泵基因，能外排溴化乙錠、結晶紫、普魯黃和羅丹明等多種抗菌染料。

目前檢測mdfA基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現假陰性；測序是檢測基因突變的金標準，但測序技術步驟繁瑣、耗時長、容易污染。

發明內容

本發明的目的是提供大腸埃希菌中耐消毒劑mdfA基因攜帶情況的PCR檢測引物及使用該引物的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明提供了一組大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物，其特征在于，包括：

(A).mdfA基因正向引物：5′-ttccctctctgtctggtgct-3′；

(B).mdfA基因反向引物：5′-cccagcagccattgtaaaaa-3′。

本發明還提供了一種大腸埃希菌中mdfA基因的檢測方法，其特征在于，采用上述大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物，具體步驟為：

第一步：取經培養后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶mdfA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成mdfA序列，構建攜帶mdfA基因的重組質粒為陽性對照品；

第二步：用無菌水配制濃度為5-15umol/L的mdfA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的mdfA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的mdfA基因檢測探針溶液；mdfA基因正向引物的序列為：5′-tccctctctgtctggtgct-3′，mdfA基因反向引物的序列為：5′-ccagcagccattgtaaaaa-3′，mdfA基因檢測探針的序列為：FAM-tggcgggcgggatg-MGBNFQ；

第三步：在每一個PCR反應孔中依次加入PCR?Master?Mix?10-15ul和第二步得到的mdfA基因正向引物溶液0.1-1ul、mdfA基因反向引物溶液0.1-1ul、mdfA基因檢測探針溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品0.1-1ul，用滅菌重蒸餾水補足25ul；在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為40-60℃保溫1-3分鐘，80-100℃保溫1-3分鐘，再運行30-50個循環，每個循環包括在80-100℃保溫10-20秒，再在50-70℃保溫0.5-1.5分鐘；

第四步：用軟件SDS2.2進行結果分析，PCR結果呈S形曲線即為攜帶mdfA基因。

本發明是對大腸埃希菌中是否還有耐消毒劑mdfA基因的檢測，細菌一旦獲得此基因即可對現用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測了解細菌中mdfA基因的攜帶情況，有利于對含有耐消毒劑基因的菌株的監控，防止菌株繼續流行，同時從科研角度對其耐藥機理的進一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發。