[發明專利]大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210033135.9
• 申請日: 2012-02-14
• 公開（公告）號: CN102605053A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 傅詠南;張奕;王校
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

1.大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物，其特征在于，包括：

(A).mdfA基因正向引物：5′-ttccctctctgtctggtgct-3′；

(B).mdfA基因反向引物：5′-cccagcagccattgtaaaaa-3′。

2.一種大腸埃希菌中mdfA基因的檢測方法，其特征在于，采用權利要求1所述的大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物，具體步驟為：

第一步：取經培養后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶mdfA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成mdfA序列，構建攜帶mdfA基因的重組質粒為陽性對照品；第二步：用無菌水配制濃度為5-15umol/L的mdfA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的mdfA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的mdfA基因檢測探針溶液；mdfA基因正向引物的序列為：5′-ttccctctctgtctggtgct-3′，mdfA基因反向引物的序列為：5′-cccagcagccattgtaaaaa-3′，mdfA基因檢測探針的序列為：FAM-tggcgggcgggatg-MGBNFQ；

第三步：在每一個PCR反應孔中依次加入PCR?Master?Mix?10-15ul和第二步得到的mdfA基因正向引物溶液0.1-1ul、mdfA基因反向引物溶液0.1-1ul、mdfA基因檢測探針溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品0.1-1ul，用滅菌重蒸餾水補足25ul；在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為40-60℃保溫1-3分鐘，80-100℃保溫1-3分鐘，再運行30-50個循環，每個循環包括在80-100℃保溫10-20秒，再在50-70℃保溫0.5-1.5分鐘；

第四步：用軟件SDS2.2進行結果分析，PCR結果呈S形曲線即為攜帶mdfA基因。