[發(fā)明專利]一種聾病易感基因SLC26A4 IVS7-2A>G熒光檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210033126.X
• 申請日: 2012-02-14
• 公開（公告）號: CN102559910A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 萬戈江;魏宏泉;步訊;夏子芳
• 申請（專利權(quán)）人: 北京科聆金儀生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測聾病易感基因SLC26A4突變熱點IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的熒光檢測試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

SLC26A4基因與弧立的大前庭水管綜合征及Pendred綜合征(前庭水管擴大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫)的關(guān)系密切，臨床上表現(xiàn)為先天性或后天性耳聾，耳聾發(fā)生或加重與外傷、感冒有關(guān)。通過顳骨CT掃描可以得出結(jié)論，但目前由于設(shè)備和專業(yè)人員的限制，中國大部分地區(qū)的醫(yī)院不能進行高分辨率的顳骨CT掃描，導致許多地區(qū)無法診斷大前庭水管綜合征。?

通過對SLC26A4基因的檢測，則可以在全國范圍內(nèi)實現(xiàn)對80％以上大前庭水管綜合征的準確診斷，并先于CT檢查發(fā)現(xiàn)和確診大前庭水管綜合征，這一方法可以避免放射線檢查的輻射問題，更易為患者家屬接受，并且由于基因診斷操作能夠批量進行，可以在大標本范圍內(nèi)進行篩查。大量研究表明，存在于中國人群突變熱點區(qū)域為：SLC26A4基因外顯子8的側(cè)翼序列的IVS7-2A＞G。?

目前常用的基因檢測方法有：直接測序(direct?sequencing，DS)、連接酶檢測反應(ligase?detection?reaction，LDR)、限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction?fragment?length?polymorphism，RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing?high?performance?liquid?chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復性差、假陰性假陽性多等問題。?

采用熒光標記技術(shù)、毛細管電泳技術(shù)，通過帶熒光標記物的引物對SLC26A4基因的IVS7-2A＞G位點特異性的擴增，并在此引物中摻入核酸類似物提高引物的Tm值，進一步增強引物的特異性，而后經(jīng)毛細管電泳后分析PCR產(chǎn)物出峰情況，即可實現(xiàn)對耳聾基因位點的檢測。該方法靈敏度高、判讀清晰準確，僅需采取少量血樣或口腔拭子樣本，即可進行檢測，采樣方便尤其適合新生嬰幼兒樣本的采集。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種聾病易感基因SLC26A4突變熱點IVS7-2A＞G熒光檢測試劑盒。?

為了實現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案：一種聾病易感基因SLC26A4突變熱點IVS7-2A＞G熒光檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增試劑和擴增后的基因分型用試劑；?

所述擴增前試劑包括：PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs的混合物，Taq酶，2對引物混合物以及超純水；?

所述擴增后試劑包括：用于基因分型的對應于SLC26A4基因突變熱點IVS7-2A＞G檢測和Amelogenin性別鑒定基因座的等位基因標準物的混合物和內(nèi)標ROX-300；?

使用所述的試劑盒進行PCR復合擴增反應的條件：PCR擴增體系的pH值為8.0-9.0，鎂離子濃度為1.5-3.5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μM，Taq酶的用量為0.1-0.4U/μL，2對引物混合物中的單對引物終濃度為0.2-0.4μM。?

使用所述試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應在一個復合擴增反應體系中同時擴增SLC26A4基因的IVS7-2A＞G和Amelogenin基因座。?

用于SLC26A4基因IVS7(-2)位點A＞G突變檢測的引物為：SEQ?NO.01和SEQ?NO.02.X。?

SEQ?NO.02.X為下列摻入了LNA核苷的引物中的任意一條(LNA核苷以黑體字表示)：?

SEQ?NO.02.1：5’-G?TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3’?

SEQ?NO.02.2：5’-GTTTTTAACATCT?TTGTTTTATTTAG-3’?

SEQ?NO.02.3：5’-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTT?G-3’。?

用于Amelogenin基因座檢測的引物為：SEQ?NO.03：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQ?NO.04：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。?

所述的2對引物，其中每對引物中有一條引物的5’端進行熒光染料標記，所用的熒光染料可以為相同或不同的熒光素。?

所述復合擴增采用聚合酶鏈式反應來實現(xiàn)，采用多道或單道毛細管電泳進行檢測。?