[發明專利]MRSA中QacC基因的檢測引物及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210033096.2
• 申請日: 2012-02-14
• 公開（公告）號: CN102586432A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 傅詠南;張奕;王校
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12N15/11
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術領域

本發明涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒劑QacC基因攜帶情況的檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

隨著抗菌藥物的廣泛應用，細菌的耐藥性越來越嚴重，并出現了多重耐藥株。研究發現，多重耐藥菌株中的主動外排系統能夠顯著降低細胞內抗菌藥物的濃度，同時由于主動外排系統轉運底物的廣泛性，使細菌呈現對多種化學結構完全不同的抗菌藥物高度耐藥。進一步研究表明，細菌的主動外排是導致細菌產生多重耐藥的主要原因。研究認為MRSA的耐藥可能跟細菌獲得主動外排基因有關，現已發現MRSA中存在多種主動外排系統。Markham等早在1996年就推測外排系統在MRSA多重耐藥機制中發揮重要作用。金黃色葡萄球菌還存在qac，smr等多種外排系統。Qac基因家族中發現有QacA，QacB，QacC，QacD，QacE等基因。細菌獲得Qac基因可表現對胺類、胍類、腙類消毒劑也耐藥。在Qac家族中，除對消毒劑耐藥外，對多種抗菌藥物存在高耐藥率。

QacC基因可從金葡菌小質粒和大質粒如214kb的pSK89、pSK108和4718kb的pSK41中分離得到；在凝固酶陰性葡萄球菌的結合型質粒PNVH99中也發現它的存在。后來從食品中分離得到的葡萄球菌經核酸測序證明，qacC與sm?r僅有一個核苷酸的不同。qacC基因編碼的蛋白含有107個氨基酸，屬于原核多重耐藥家族，這個家族中還包括大腸埃希菌編碼蛋白Ebr和革蘭陰性桿菌的整合子編碼蛋白QacE。該家族的蛋白均有四個跨膜片段，它們依靠質子泵的動力對季胺類化合物和溴化己啶等消毒劑耐藥。

目前檢測QacC基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現假陰性；測序是檢測基因突變的金標準，但測序技術步驟繁瑣、耗時長、容易污染。

發明內容

本發明的目的是提供耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒劑QacC基因攜帶情況的PCR檢測引物及使用該引物的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明提供了一組MRSA中QacC基因的檢測引物，其特征在于，包括：

(A).QacC基因正向引物：5’-tgcaacacctaccactaaatataactt-3’；

(B).QacC基因反向引物：5’-cgaaactacgccgactatga-3’。

本發明還提供了一種MRSA中QacC基因的檢測方法，其特征在于，采用上述MRSA中QacC基因的檢測引物，具體步驟為：

第一步：取經培養后鑒定為MRSA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶QacC基因的金黃色葡萄球菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成QacC序列，構建攜帶QacC基因的重組質粒為陽性對照品；

第二步：用無菌水分別配制濃度為5-15umol/L的QacC基因正向引物溶液、濃度為5-15umol/L的QacC基因反向引物溶液及濃度為5-15umol/L的QacC基因檢測探針溶液；QacC基因正向引物的序列為：5’-tgcaacacctaccactaaatataactt-3’，QacC基因反向引物的序列為：5’-cgaaactacgccgactatga-3’，QacC基因檢測探針的序列為：FAM-gcaacttgggcggga-MGBNFQ；

第三步：在每一個PCR反應孔中依次加入PCR?Master?Mix?10-15ul和第二步得到的QacC基因正向引物溶液0.1-1ul、QacC基因反向引物溶液0.1-1ul、QacC基因檢測探針溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各0.1-1ul，用滅菌重蒸餾水補足25ul；在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為40-60℃保溫1-3分鐘，80-100℃保溫1-3分鐘，然后運行30-50個循環，每個循環包括在80-100℃保溫10-20秒，再在50-70℃保溫0.5-1.5分鐘；

第四步：用軟件SDS2.2進行結果分析，PCR結果呈S形曲線即為攜帶QacC基因。

本發明是對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中是否還有耐消毒劑QacC基因的檢測，細菌一旦獲得此基因即可對現用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測了解細菌中QacC基因的攜帶情況，有利于對含有耐消毒劑基因的菌株的監控，防止菌株繼續流行，同時從科研角度對其耐藥機理的進一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發。