[發(fā)明專利]一種蛇傷快速鑒別的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210032755.0
• 申請日: 2012-02-13
• 公開（公告）號: CN102590496A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設計）人: 高建芳;王金;屈彥福;馬小梅;計翔
• 申請（專利權）人: 高建芳;王金;屈彥福;馬小梅;計翔
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發(fā)明屬于蛇傷鑒別方法，具體為一種利用包被有蛇毒特異性抗體的酶標條快速鑒別蛇傷的方法。

背景技術

傳統(tǒng)蛇傷類型判斷是依靠蛇傷臨床癥狀分析來實現(xiàn)的，由于醫(yī)者經驗不足、臨床癥狀不明顯或已擴散至無法判斷，就會導致誤判，耽誤蛇傷治療。為避免傳統(tǒng)蛇傷判定的缺陷，世界范圍內已有一些國家開展以蛇毒特異性抗體來制備蛇傷快速診斷產品的研究，相關診斷產品利用被蛇類咬傷患者的體液能在短時間內準確地判定蛇傷類型，從而保障抗蛇毒血清的準確使用。盡管有研究表明膠體金、乳膠凝集法等方法在技術上都能用于鑒別蛇毒，從而確定蛇傷類型，但鑒于成本高或者操作復雜等原因，至今尚未有產品得以實際應用。酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)在蛇毒鑒別中運用最為廣泛，其中澳大利亞已經生產蛇傷快速診斷試劑盒用于臨床檢測，為蛇傷的快速判斷與治療作出了積極的貢獻。我國是蛇類資源大國，長江以南地區(qū)普遍分布有各類毒蛇，在每年的活動旺季，對當?shù)氐娜祟惢顒釉斐闪藝乐氐奈：?。但迄今為止，國內對蛇傷類型的判斷仍舊依靠其臨床癥狀表現(xiàn)，缺乏快速、簡單、有效的診斷方法用于臨床輔助判斷蛇傷。

發(fā)明內容

鑒于上述問題，本發(fā)明提供一種蛇傷快速鑒別的方法，其特征在于按如下步驟進行：

1.制備抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。選取所需鑒別的6種蛇毒，用20mM?PBS溶解后，離心取上清，并測定蛋白含量。皮下多點注射大鼠，制備6種多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先經過硫酸銨沉淀去除非蛋白組分，再通過Hitrap?protein?IgG柱純化，獲得6種抗蛇毒IgG。

2.篩選蛇毒物種特異性IgG。將蛇毒偶聯(lián)至活化的CNBr-activated?sepharose?4B親和介質上，等量任取5種蛇毒偶聯(lián)后的濕潤親和介質共0.3g混合后裝入離心濃縮管內管。室溫下，500μg的每種蛇毒的抗血清IgG分別與其余種蛇毒偶聯(lián)的親和介質在水平搖床溫和地混勻2小時。隨后離心，用離心濃縮管外管收集未結合組分的洗出液，即為該種蛇毒區(qū)別于其它5種蛇毒的物種特異性IgG。

3.蛇毒特異性IgG生物素化。特異性抗體和生物素重量比1∶5混合后，室溫震蕩結合2小時，隨后透析去除未結合生物素，得到生物素化特異性IgG。

4.檢測酶標條制作。以8孔酶標條為載體，配有一個“T”形支架。酶標條上設置6個樣品檢測孔，1個陽性和1個陰性對照孔。各孔經2％牛血清封閉，漂洗控干后在-20度保存。

5.蛇傷快速鑒別。檢測時，采集蛇傷患者傷口部位流出液，滴加至各檢測孔，依次經過生物素化特異性抗體、親和素化HRP的結合后，加入TMB顯色，根據(jù)檢測孔的陽性或者陰性結果準確判斷蛇傷類型。

上述一種蛇傷快速鑒別方法，具有如下優(yōu)點：

1.成本低。各種特異性抗體的篩選、測試條和測試過程輔助試劑的制備成本低，無需昂貴的耗材支撐。

2.操作簡單。整個檢測過程所需組件簡單、體積小，無需借助儀器，檢測人員無需豐富的臨床診斷經驗。

3.檢測時間短。從低溫下取出測試條到顯色結束，用時40-45分鐘，在蛇傷發(fā)生現(xiàn)場或患者運送過程中就能完成。

4.準確性高。借助抗原抗體特異性結合原理，能有效保證待測樣品中蛇毒結合到特異性抗體上。借助生物素-親和素結合原理，能將最終顯色效果的信號較傳統(tǒng)的雙抗夾心法放大4倍，有效保證陽性檢測結果能被肉眼準確識別。

本發(fā)明已列入杭州市屬高校重點實驗室科技創(chuàng)新項目(項目合同號：20080433T03)和浙江省科學技術廳重大科技專項項目(項目合同號：2009C13045)。

附圖說明

圖1是8孔酶標條的結構示意圖。

圖2是附著有酶標條的“T”形支架的垂直示意圖。

圖3是實施例中無毒蛇咬傷的示意圖。

圖4是實施例中銀環(huán)蛇咬傷的示意圖。

圖5是實施例中眼鏡蛇咬傷的示意圖。

圖6是實施例中五步蛇咬傷的示意圖。

圖7是實施例中蝮蛇咬傷的示意圖。

圖8是實施例中竹葉青咬傷的示意圖。

圖9是實施例中烙鐵頭咬傷的示意圖。

圖10是實施例中測試條失效的示意圖。

圖1、2中1是陽性對照孔；2是陰性對照孔；3-8是樣品檢測孔。

具體實施方式

實施例：