[發(fā)明專利]一種比伐盧定的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210030956.7
• 申請日: 2012-02-13
• 公開（公告）號: CN102532274A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設計）人: 文永均;祝傳斌;王曉莉;韓玉;童光彬
• 申請（專利權）人: 成都圣諾生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞账?51124
• 代理人: 武森濤

技術領域

本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術領域，特別涉及一種新的比伐盧定的制備方法。

背景技術

比伐盧定(Bivalirudin)屬于直接凝血酶抑制劑(direct?thrombin?inhibitor，DTI)，由20個氨基酸殘基組成。直接凝血酶抑制劑(DTI)是一組不需要輔助因子參與而直接抑制凝血酶活性的多肽，它不僅有抗凝血功能，還能抑制血小板的聚集。與其他抗凝藥相比，其藥理作用及藥動學特點更優(yōu)越，尤其在心血管疾病中有良好的用途。

比伐盧定為水蛭素衍生物(片段)，人工合成的包含20個氨基酸殘基的多肽。它主要由兩部分構成，一部分是氨基末端(N端)的短肽鏈，含有苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸序列，能與凝血酶的活性部位發(fā)生特異性結(jié)合，另一部分是含羧基末端(C端)的12肽鏈，兩部分靠四甘氨酸連接，它們與凝血酶的兩個結(jié)合部位都有很高的親和力。比伐盧定與凝血酶的結(jié)合是可逆的，結(jié)合后很容易在凝血酶的活性部位斷開成兩部分并分解出多肽鏈中的脯氨酸-精氨酸序列，使凝血酶的催化活性很快恢復，所以它的半衰期只有20～25min。半衰期短使它比水蛭素更安全。比伐盧定主要經(jīng)肽酶降解后清除，少部分以原型經(jīng)腎排泄，所以在腎功能不全時使用安全。

比伐盧定具有以下的結(jié)構：

D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-

Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH

有關比伐盧定的制備方法，國內(nèi)外有大量的報道。

Okayama?et?al.(1996，Chem.Pharm.Bull.44：1344-1350)和Steinmetzer?et?al.(1999，Eur.J.Biochem.265：598-605)報道了比伐盧定的Fmoc固相合成法，采用王樹脂為開始的載體樹脂，依次接入保護氨基酸，所得肽樹脂采用三氟醋酸(TFA)酸解。

由于本產(chǎn)品結(jié)構的特點，本品種含有5個Gly，在固相法依次接入Fmoc-Gly過程中，由于Gly自身的特性，使產(chǎn)品中產(chǎn)生以下雜質(zhì)：[+1Gly]-比伐盧定，[+2Gly]-比伐盧定，[-1Gly]-比伐盧定，[-2Gly]-比伐盧定，而這些雜質(zhì)與比伐盧定自身的極性相近，所以在純化的時候很難完全純化掉，產(chǎn)品總收率無法得到有效提高，產(chǎn)品純度不高，影響用藥的安全性。

為了解決比伐盧定結(jié)構中Gly增加和減少問題，以色利NOVETIDE公司W(wǎng)O2010117725專利，在接肽過程中使用Fmoc-Gly-Gly-OH為原料僅僅解決了[+1Gly]-比伐盧定和[-1Gly]-比伐盧定雜質(zhì)的產(chǎn)生，而無法解決[+2Gly]-比伐盧定和[-2Gly]-比伐盧定的產(chǎn)生。

同時在制備過程中還發(fā)現(xiàn)，由于氨基酸的空間位阻大，在接入Fmoc-Arg(Pbf)-OH過程中反應不完全，易產(chǎn)生[-Arg]-比伐盧定雜質(zhì)，嚴重影響了產(chǎn)品收率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供比伐盧定的制備方法，該制備方法使用了新的保護氨基酸片段，避免了[+1Gly]-比伐盧定、[-1Gly]-比伐盧定、[+2Gly]-比伐盧定、[-2Gly]-比伐盧定雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高了產(chǎn)品收率和純度，反應效率高、有利于實現(xiàn)規(guī)模化的固相合成工藝。

本發(fā)明比伐盧定的制備方法，包括固相多肽合成法制備比伐盧定樹脂、比伐盧定樹脂酸解得到比伐盧定粗品、比伐盧定粗品純化得到比伐盧定成品，其中固相多肽合成法制備比伐盧定樹脂的方法為：在Fmoc-Leu-載體樹脂上通過固相偶聯(lián)合成法依次接入下列序列中相對應的保護氨基酸或片段，得到比伐盧定樹脂：

R₁-D-Phe-Pro-X-Y-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-

Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-樹脂

其中，

R₁為Fmoc或Boc或H；

X為Arg(Pbf)-Pro；

Y為Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R₂)-Gly-Asp(OtBu)，R₂為Trt或H。

作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，接入X片段時，

1)用1次偶聯(lián)直接接入，F(xiàn)moc-保護氨基酸或片段為：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH；或