[發明專利]一種提高Bt殺蟲蛋白在漢遜酵母中表達量的方法

有效

• 申請號: 201210030218.2
• 申請日: 2012-02-13
• 公開（公告）號: CN102533841A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 劉德虎;王楠;李剛強;劉樹鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K14/325;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N33/68;C12R1/78
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及使用一個復合增強子以實現Bt融合蛋白基因在多型漢遜酵母細胞中以組成型方式高效表達的方法，其中包括：1)使用一個復合增強子以提高密碼子優化后的Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中的產量；2)采用畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調控Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中以組成型的方式表達；3)優化后的漢遜酵母發酵培養生長條件；4)利用納濾及鎳柱親和層析快速提純該重組外源蛋白的方法。而由此方法制備的Bt重組融合蛋白可作為蛋白質標準物質備選物應用于蛋白質溯源研究等領域。

背景技術

Bt是蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis)的簡稱，屬革蘭氏陽性上壤芽胞桿菌。該細菌產生的Bt殺蟲毒蛋白能夠破壞昆蟲腸道內的細胞滲透壓，造成消化紊亂，最終導致昆蟲死亡。Bt基因是第一代抗蟲基因的典型代表，它表達的蛋白統稱為Cry晶體蛋白。根據殺蟲譜及氨基酸序列同源性的不同，Bt基因被分為不同的類型，其中Cry1Ab和Cry1Ac對鱗翅目害蟲具有專一性毒性，而其它的Bt基因則對雙翅目或鞘翅目等害蟲具有專一毒性。Bt基因通過生物技術手段轉入作物后，能夠表達具有殺蟲活性的毒蛋白并使植物具備抗蟲性。目前，國內外已經獲得轉Bt基因的作物有棉花、水稻、玉米、小麥和油菜等。

雖然現在市場上有許多可用于Bt轉基因蛋白質測定的試劑盒，但不同的廠商可能采用不同的工藝表達、分離純化原料，以及不同的方法確定參考物質的量值，而蛋白質檢測標準物質和量值溯源傳遞體系的嚴重缺乏使得不同試劑盒內所帶參考物質不能溯源到上一級的計量標準，也就無法保證不同試劑盒所帶參考物質量值的準確性與可溯源性，造成測定結果不準確和缺乏可比性，對生物安全監管帶來隱患，由此產生一系列法律、貿易等經濟和社會問題。因此，在我國范圍內，盡快研制Bt蛋白標準物質，建立起靈敏準確的定量測定方法及Bt轉基因植物蛋白量值溯源傳遞體系，對于今后保證測定結果的溯源性、準確性和可比性，顯得十分迫切且意義重大。

近幾年來，隨著人們對漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)生物學特性的深入研究，發現其作為外源基因表達宿主的優勢逐漸顯現。漢遜酵母也是一種甲醇營養型酵母，與畢赤酵母類似。漢遜酵母中甲醇代謝的主要途徑有兩種(Lodeboer?A.M.，et?al.，1985)：一種是在過氧化物酶體中進行，甲醇在甲醇氧化酶(methanol?oxidase，MOX)作用下生成甲醛和H₂O₂，甲醛再經甲醛脫氫酶(formaldehyde?dehydrogenase)和甲酸脫氫酶(formate?dehydrogenase，FMD)作用下生成CO₂，H₂O₂在過氧化氫酶(catalase，CAT)的作用下生成H₂O和O₂；甲醇的另一個代謝途徑發生在過氧化物酶體外，甲醇在細胞質中經過一系列酶的催化作用最后轉變為糖類，其中二羥丙酮合成酶(dihydroxyacetone?synthase，DHAS)是這一過程的關鍵酶。甲醇代謝過程中的各種關鍵酶，包括MOX、DHAS和CAT等的表達都是在轉錄水平進行調解的，它們受甲醇、甘油和山梨醇的誘導，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但當葡萄糖濃度低于0.1％時，陽遏作用即被解除。在甲醇完全誘導條件下，過氧化物酶體可占細胞總體積的80％，MOX和DHAS可占細胞總蛋白的15％，它們的啟動子具有極強的啟動下游基因表達的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表達的常用啟動子。誘導型啟動子以其強啟動功能和嚴緊的調控機制被廣泛的應用于外源基因的表達，已有很多外源蛋白在這些啟動子的調控下在漢遜酵母細胞中得到高效的表達。目前用于漢遜酵母外源蛋白表達系統的誘導型啟動子都需要在一定劑量甲醇存在的條件下才能發揮作用，但由于甲醇是有毒物質，且易燃易爆，這樣就限制了該系統在醫藥或食品等領域的應用。因此，各種組成型啟動子就應運而生，已經成功應用于漢遜酵母外源蛋白表達系統的組成型啟動子有質膜ATPase啟動子(pPMA1)和翻譯延伸因子1a啟動子(TEF1)等，這些組成型啟動子的應用不僅無需在發酵培養基中加入甲醇，而且也簡化了發酵工藝和降低了成本等。