[發(fā)明專利]一種提高Bt殺蟲蛋白在漢遜酵母中表達(dá)量的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210030218.2 | 申請日： | 2012-02-13 |
| 公開（公告）號： | CN102533841A | 公開（公告）日： | 2012-07-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉德虎;王楠;李剛強(qiáng);劉樹鵬 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 |
| 主分類號： | C12N15/81 | 分類號： | C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K14/325;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N33/68;C12R1/78 |
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| 地址： | 100081 北*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 提高 bt 殺蟲 蛋白 酵母 表達(dá) 方法 | ||
1.一種使用復(fù)合增強(qiáng)子以提高Bt融合蛋白在漢遜酵母表達(dá)量的方法。
2.如權(quán)利要求1中的方法，其中所說的復(fù)合增強(qiáng)子具有序列表中的1所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1中的方法，編碼Bt融合蛋白的DNA序列，其特征在于具有序列表3中所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1中的方法，需構(gòu)建一種表達(dá)質(zhì)粒載體，其特征在于它含有權(quán)利要求2所述的復(fù)合增強(qiáng)子序列及權(quán)利要求3中所述的編碼Bt融合蛋白的DNA序列。
5.如權(quán)利4中所述的表達(dá)載體，其特征在于，在構(gòu)建表達(dá)載體時，采用的起始載體為pPIC9K或其他能夠組成型表達(dá)并分泌重組蛋白到胞外的質(zhì)粒載體。
6.如權(quán)利要求1中的方法，需要一種酵母宿主細(xì)胞，其特征在于它包含權(quán)利要求4和5中所述的表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求6中所述的宿主細(xì)胞，它是指漢遜酵母菌株A16或其他能夠表達(dá)外源基因的酵母菌株。
8.利用權(quán)利要求7所述的漢遜酵母菌株A16高效表達(dá)和生產(chǎn)Bt重組融合蛋白的方法，其中包括了四個階段：
1)種子液制備：挑取酵母單菌落，接種于10mL?YPD液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mL?YPD培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24小時后，將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于3L?BMGY培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48小時，然后將其作為種子液；
2)初培養(yǎng)階段：在20L發(fā)酵罐中盛放了10L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[10×Basal?Salts：2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀+4％甘油]，在接種前先加入氨水使該培養(yǎng)基的pH值維持在4.0左右，再按照下述比例，在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4.37mL微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅，0.008％碘化鈉，0.3％硫酸錳，0.02％鉬酸鈉，0.002％硼酸，0.05％氯化鈷，2％氯化鋅，6.5％硫酸亞鐵，0.025％生物素，0.5％硫酸)。按占基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基體積10％的比例接種此前制備好的種子液，37℃通氣攪拌(轉(zhuǎn)速自始至終維持在375轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)24小時左右；
3)蛋白大量表達(dá)階段：從接種后的第二天，通過蠕動泵流加補(bǔ)料液，補(bǔ)料液為50％甘油(其中含有12mL?PTM1/L)，流加量為18mL/L/天。37℃通氣攪拌培養(yǎng)至72h，用氨水維持pH值在4.0左右，同時調(diào)整通氣量使此階段的溶氧量始終維持在20％以上。
4)發(fā)酵液經(jīng)5000rpm?4℃離心10分鐘，留取上清。用截流分子量為10KDa的納濾膜處理上清液，保留回流液。用蒸餾水將回流液稀釋10倍，然后再通過10KDa的納濾膜處理，如此重復(fù)操作5次。將回流液冷凍干燥后，可得到初步提純的Bt重組蛋白凍干粉。將其重新懸浮于50mL的20mMTris-HCl緩沖液中(pH7.9，含5mM咪唑，0.5M?NaCl)。準(zhǔn)備20mL的鎳柱，首先用無菌水洗柱(10倍柱床體積)，流速1mL/mim，然后用上樣緩沖液I(10mM?Tris-HCl，pH7.9，含0.25M?NaCl)進(jìn)行平衡(10倍柱床體積)，流速為1mL/min。將上述蛋白樣品液以1mL/min的速度加入到柱子中。用上樣緩沖液I繼續(xù)平衡(10個柱床體積)，然后分別用含有50mM、100mM及400mM咪唑的10mM?Tris-HCl緩沖液(pH7.9，含0.25MNaCl)進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min，收集含Bt目標(biāo)蛋白階段的洗脫液，匯合后凍干。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的Bt重組融合蛋白經(jīng)高度純化后可作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)備選物應(yīng)用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。
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