[發(fā)明專利]小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的滾環(huán)擴(kuò)增快速檢測引物及試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210030161.6
• 申請(qǐng)日: 2012-02-11
• 公開（公告）號(hào): CN102534023A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜英輝;王濱;張健;尼秀媚;李正義;唐靜;馬維興;雷質(zhì)文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

1.一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的滾環(huán)擴(kuò)增快速檢測的引物及探針，其中：與探針特異性結(jié)合的引物序列為SEQ?ID?NO：1；

與以探針為模板所擴(kuò)增的片段相結(jié)合的引物序列為SEQ?ID?NO：2；

探針的序列為SEQ?ID?NO：3。

2.如權(quán)利要求1所述的引物及探針，其特征在于所述的探針的5’端進(jìn)行磷酸化修飾。

3.一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的滾環(huán)擴(kuò)增快速檢測試劑盒，包括如下的組分：

(1)探針結(jié)合反應(yīng)液：

其中包括10×Taq?DNA連接酶緩沖液，200pmol·L^-1序列為SEQ?IDNO：3的探針，40U·μL^-1Taq?DNA連接酶；

所述的10×Taq?DNA連接酶緩沖液成分為：20mmol/L?Tris-HCl，25mmol/L乙酸鉀，10mmol/L乙酸鎂，1mmol/L?NAD，10mmol/LDithiothreitol(二巰基蘇糖醇)，0.1％Triton?X-100pH?7.6；

(2)外切處理反應(yīng)液：

包括10×Exonuclease?I緩沖液，5U·μL^-1Exonuclease?I；

所述的10×Exonuclease?I緩沖液成分為：67mmol/L?Glycine-KOH，6.7mmol/L?MgCl₂，10mmol/L?2-巰基乙醇，pH?9.5；

(3)RCA恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：

包括10×Bst?DNA聚合酶緩沖液，10μmol·L^-1序列為SEQ?ID?NO：1的引物，10μmol·L^-1序列為SEQ?ID?NO：2的引物，10mmol·L^-1dNTPs，8U·μL^-1Bst?DNA聚合酶；

所述的10×Bst?DNA聚合酶緩沖液成分為：

20mmol/L?Tris-HCl，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，10mmol/L?KCl，2mmol/LMgSO₄，0.1％Triton?X-100，pH?8.8。

4.權(quán)利要求1所述的引物和探針用于檢測食品中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

5.權(quán)利要求3所述的試劑盒用于檢測食品中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒的應(yīng)用，其使用方法包括如下的步驟：

(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA模板的提取：

提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA?OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范圍內(nèi)，濃度在10ng/μL～100ng/μL范圍內(nèi)；

(2)探針結(jié)合反應(yīng)：

將裝有8μL探針結(jié)合反應(yīng)管中加入2μL待檢模板DNA，94℃4min；94℃30s，60℃5min，15個(gè)循環(huán)；95℃變性15min，并快速置于冰上冰浴5min；

(3)外切處理反應(yīng)：

在裝有10μL外切處理反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入10μL步驟(2)所得的產(chǎn)物，37℃溫浴2.5h，80℃15min；反應(yīng)結(jié)束后取出；

(4)RCA恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：

在裝有21μL?RCA恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入4μL步驟(3)所得的產(chǎn)物，60℃反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束后取出；

(5)反應(yīng)結(jié)果的檢測：

使用凝膠電泳的方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物，取5μL產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)電泳的結(jié)果判斷檢測物是否為陽性。