[發(fā)明專利]小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的滾環(huán)擴增快速檢測引物及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210030161.6
• 申請日: 2012-02-11
• 公開（公告）號: CN102534023A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜英輝;王濱;張健;尼秀媚;李正義;唐靜;馬維興;雷質(zhì)文
• 申請（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于致病微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的滾環(huán)擴增快速檢測引物及試劑盒，即利用滾環(huán)恒溫擴增(RCA)技術(shù)進行菌樣的快速檢測的引物其應(yīng)用。

背景技術(shù)

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是引起急性胃腸炎型食物中毒的病原菌，為人畜共患病。其潛伏期約攝食后3-7天，病程一般為1-3天，但有些病例持續(xù)5-14天或更長。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌感染后的主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、嘔吐、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等。本菌的易染人群為嬰幼兒，常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。而且小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分布很廣，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉類、豆制品、沙拉、牡蠣、蛤蜊和蝦中。也存在于野生環(huán)境中，如湖泊、河流、土壤和植被。因此，有效的檢測出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌對于食品安全是非常重要的。目前小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測方法主要有常規(guī)分離鑒定法、普通PCR檢測法、熒光定量PCR檢測法等。但上述的方法或是存在耗時過長、或是應(yīng)用儀器昂貴，難以在實際中推展。因此，需要開發(fā)出另一種能夠有效的檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法及其相應(yīng)的引物，以及包含該引物的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的滾環(huán)擴增快速檢測引物及試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的主要原理如下：

(1)設(shè)計一條兩端能夠與目標(biāo)序列特異性結(jié)合的鎖式探針，與目標(biāo)序列結(jié)合時可以形成一個閉合環(huán)狀。

(2)設(shè)計兩條引物，一條(引物XCR)可以與鎖式探針形成的環(huán)特異性結(jié)合，另一條(引物XCF)可以與以鎖式探針為模板所擴增的片段相結(jié)合。

(3)將探針和目標(biāo)菌的模板DNA加入到模板預(yù)處理反應(yīng)液，在DNA連接酶作用下，通過幾個預(yù)變性和連接的循環(huán)過程，鎖式探針與目標(biāo)菌DNA特異性結(jié)合，并形成環(huán)狀。

(4)核酸外切酶I及其緩沖液加入連接后的混合液中，降解未形成環(huán)狀的鎖式探針。

(5)在具有鏈置換活性的Bst?DNA聚合酶的作用下，引物P1擴增環(huán)狀鎖式探針，在延伸至探針與靶序列結(jié)合處時把靶序列置換下來進入滾環(huán)指數(shù)擴增；

(6)待置換出環(huán)形DNA模板的互補單鏈(第一次線性RCA產(chǎn)物)后，引物P2與其結(jié)合并進行酶促延伸反應(yīng)。隨著線性RCA的進行，由與環(huán)狀DNA完全互補的重復(fù)序列組成的線性單鏈不斷延長，同時更多的引物P2結(jié)合上去進行延伸合成，后結(jié)合的引物P2的延伸置換先結(jié)合的引物P2的延伸產(chǎn)物，被置換下的P2延伸產(chǎn)物再與P1結(jié)合，進行P1延伸合成；

(7)最終擴增出的產(chǎn)物為以環(huán)形探針為單位的不同長度的雙鏈DNA

(8)擴增產(chǎn)物利用電泳方法檢測。

本發(fā)明的一個方面涉及用于恒溫擴增快速檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的引物及探針，

其中與探針特異性結(jié)合的引物序列(XCR)為SEQ?ID?NO：1：

XCR：5-CAATAGGTCCAGAATGTCAG-3；

與探針為模板所擴增的片段相結(jié)合的引物序列(XCF)為SEQ?ID?NO：2：

XCF：5-GGAAAGCAAATGTCGCACCT-3；

探針序列為SEQ?ID?NO：3(XCPLP)：

5-GGACCATCAGGTGCGACATTTGCTTTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACTGCCATTCATCCGCTTATTATCACCGTTTGTCCTAATCTATG-3，

探針的5’端進行磷酸化修飾。

本發(fā)明的另一個方面涉及一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下的組分：

(1)探針結(jié)合反應(yīng)液：

其中包括10×Taq?DNA連接酶緩沖液，200pmol·L^-1鎖式探針，40U·μL^-1TaqDNA連接酶；

所述的10×Taq?DNA連接酶緩沖液成分為：20mmol/L?Tris-HCl，25mmol/L乙酸鉀，10mmol/L乙酸鎂，1mmol/L?NAD，10mmol/L?Dithiothreitol(二巰基蘇糖醇)，0.1％Triton?X-100pH?7.6。

(2)外切處理反應(yīng)液：

包括10×Exonuclease?I緩沖液，5U·μL^-1Exonuclease?I。