[發(fā)明專利]一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210029457.6
• 申請日: 2012-02-10
• 公開（公告）號: CN102603817A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李賢良;郗存顯;王國民;李應(yīng)國;唐柏彬;張雷
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C07H13/12
• 分類號: C07H13/12;C07H1/06
• 代理公司: 重慶市恒信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸藥對照品試劑制備領(lǐng)域，具體涉及一種黃霉素預(yù)混劑中提取、純化黃霉素A對照品的方法。

背景技術(shù)

黃霉素為磷酸化多糖類抗生素，具有抗菌作用機(jī)理，是通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)肽聚糖的生物合成從而抑制細(xì)菌的繁殖，黃霉素的促生長原理可能在他能提高飼料中能量和蛋白質(zhì)的消化，能使腸壁變薄，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，能有效地持續(xù)腸道菌群的平衡和瘤胃pH值的穩(wěn)定。細(xì)菌對黃霉素不易產(chǎn)生耐藥性，黃霉素也不容易與其他抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性。

黃霉素主要包括黃霉素A、B1、Ba和C等，其中黃霉素A為主要有效成分，占50%以上。黃霉素只用作飼料添加劑，不作為治療用藥，具有抗生素類添加劑的防病和促生長等作用。黃霉素抗菌譜較窄，主要對革蘭氏陽性菌有效，且對其他抗生素耐藥性的革蘭氏陽性菌也有效，但對革蘭氏陰性菌作用很弱。對牛，豬、雞、兔都有促生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用。美國FDA規(guī)定：肉雞每噸飼料添加1～2g，火雞為每噸1～2g，豬為每噸2～4g。日本每噸雞飼料添加0.5～5g，腐乳豬為5～10g，仔豬為1～10g。

現(xiàn)有黃霉素對照品為生物發(fā)酵法制備，黃霉素A純度不高，約50%～70%左右，含有黃霉素B1、Ba和C等副產(chǎn)物，不適用于黃霉素A殘留檢測使用。本發(fā)明從黃霉素預(yù)混劑中提取純化的黃霉素A對照品，純度高達(dá)93%～99％，雜質(zhì)少，步驟簡便，成本低廉，主要應(yīng)用于黃霉素殘留檢測領(lǐng)域。

黃霉素A對照品的用途，即本發(fā)明的推廣應(yīng)用前景：持續(xù)使用抗生素所引起的畜產(chǎn)品抗生素殘留以及動物和人類出現(xiàn)耐藥性問題已經(jīng)越來越為人們所重視。20世紀(jì)80年代以來，越來越多的國家立法禁止濫用抗生素。畜禽飼料中慎用抗生素原則和限制抗生素促進(jìn)生長劑，必定是未來養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的趨勢。1997年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）要求停止或禁止抗生素飼料添加劑。1998年12月又提議在10年內(nèi)淘汰抗生素飼料添加劑。目前，聯(lián)合國FAO，WTO組織及發(fā)達(dá)國家特別規(guī)定人用抗生素不得用于動物，對使用抗生素有極嚴(yán)格的要?dú)埾拗疲踔镣耆粶?zhǔn)使用。歐盟已經(jīng)決定從2006年1月起，禁止在飼料中使用莫能霉素（monensin），鹽霉素（salinomycin），卑霉素（Avilamycin），黃霉素（Flavophospholipol）等4種生長促進(jìn)因子類抗生素，這意味著歐盟將會全面禁止在飼料中投放任何種類的抗生素。在日本肯定表制度中，黃霉素沒有規(guī)定畜禽肌肉及內(nèi)臟殘留限量，按照“一律標(biāo)準(zhǔn)”原則，即沒有規(guī)定殘留限量的化合物一律按10μg/kg限量來執(zhí)行，黃霉素的殘留限量為10?μg/kg。動物源性食品中抗生素殘留的檢出，已成為世界肉類貿(mào)易中重要的技術(shù)指標(biāo)和技術(shù)壁壘之一。由于黃霉素在我國養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用，歐盟、日本等國家對我國出口動物產(chǎn)品的藥物殘留限制提出了更嚴(yán)格的要求，必將對我國動物源性食品出口帶來了嚴(yán)重影響。為了突破抗生素殘留限制的技術(shù)壁壘，對畜禽產(chǎn)品中黃霉素殘留進(jìn)行檢測和監(jiān)控，制備高純度的黃霉素A對照品顯得非常必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從黃霉素預(yù)混劑中提取純化黃霉素A對照品的方法，利用該方法制備的黃霉素A純度達(dá)到93%以上。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法，包括如下步驟：

（1）提取

以每mL甲醇與0.4g黃霉素預(yù)混劑的比例混合二者并加入離心試管中，將離心試管置于超聲提取器中，超聲提取30min，每10min振蕩一次，8000轉(zhuǎn)/min下離心3min，將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；在殘?jiān)屑尤爰状及凑丈鲜霾襟E，重復(fù)提取2次；合并每次提取的上清液，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到提取物。

（2）SPE純化

依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C₁₈固相萃取小柱，控制流速為1～2mL/min；將提取物用10mL超純水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并擠干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷與二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯與甲醇的混合溶液淋洗除雜；最后用6mL甲醇將黃霉素從固相萃取小柱中解析，將解析液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到黃霉素純化產(chǎn)物；將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至稱量皿中，-75℃真空冷凍干燥5h，即得黃褐色黃霉素A粗產(chǎn)品。

（3）HPLC純化

稱取黃霉素A粗產(chǎn)品，用流動相溶解并稀釋成2～10mg/mL，過0.45mm濾膜，按下列條件分離純化，收集洗脫液。

分離純化條件：