[發明專利]基因工程菌、用其制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用

有效

• 申請號: 201210027921.8
• 申請日: 2012-02-09
• 公開（公告）號: CN102559572A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 鄒炳德;鄒繼華;賈江花;章玉勝
• 申請（專利權）人: 寧波美康生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/14;C12Q1/34;C12R1/19
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及的是一種基因工程菌及其表達制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的生產方法，以及該酶酶學性質的測定和在L-同型半胱氨酸檢測試劑盒中的應用，具體為基因工程菌、用其制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用。

背景技術

同型半胱氨酸(Hcy)即2-氨酸-4-巰基丁酸，也稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，參與甲硫氨酸的代謝過程，可被甲基化生產蛋氨酸，或被轉硫化作用生成半胱氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產物，并可釋放到血液中。它涉及亞甲基四氫葉酸還原酶、胱氨醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶等多種代謝調節酶；也涉及調節酶的多種輔助因子如葉酸、維生素B6和維生素B12。當上述酶基因突變或輔助因子缺乏，會導致甲硫氨酸的代謝產物Hcy的轉化受阻，使血漿中Hcy水平升高。目前研究認為，Hcy水平的升高與心、腦血管及周圍血管動脈粥樣硬化病變有關，并與老年癡呆、腎功能衰竭、流產及糖尿病早亡有關，所以Hcy的體外檢測具有重要的臨床價值，可用于預測腦血管疾病發生的危險性。

目前檢測血漿中Hcy的方法很多，主要有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)。HPLC法操作復雜、耗時且費用較高；ELISA法操作方便、快捷、重復性好，但是大部分操作仍需手工操作，不適合臨床大批量標本同時測定。目前循環酶法測定高半胱氨酸(Hcy)容易自動化，測定時間短，可以在自動生化分析儀上進行，測定靈敏度高。該方法利用的主要技術原理利用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)在三乙羧乙基膦(TECP)作用下，氧化型同型半胱氨酸轉化為游離型Hcy，游離型Hcy與共價底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)催化反應形成蛋氨酸和S腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)。AdoHcy被AdoHcyase水解成腺苷(Ado)和Hcy，生成物Ado立即水解為次黃嘌呤和氨，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下，使NADH轉化為NAD+，樣本中的Hcy的濃度與NADH的變化成正比。

AdoHcyase在Hcy的循環酶法檢測中具有重要的作用，然而目前現有的AdoHcyase催化AdoHcy水解反應的Km值偏高，生產方法繁瑣，導致在試劑盒配方中，所需酶量偏多，試劑盒成本偏高，一定程度上限制了循環酶法在Hcy檢測中的應用。

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供一種基因工程菌。

該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，保藏編號為CGMCCNo.5654，保藏日期：2011.12.26，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該工程菌是通過PCR技術從環境基因組文庫中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)基因，插入到含有T7強啟動子的PET28質粒中，化學轉化導入大腸桿菌BL21中，獲得高效表達AdoHcyase的基因工程菌。

上述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ?ID.No.1所示核苷酸序列和由上述核苷酸序列編碼的如SEQ?ID.No.2所示的氨基酸序列。

該基因工程菌菌株的典型培養特征為：形態特征：菌落乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和背面顏色一致。

生理生化特征：具有大腸桿菌的生理生化特性，同時插入了AdoHcyase基因，具有高效表達AdoHcyase特性。

本發明上述的基因工程菌是這樣獲得的：

(1)用提取試劑盒從環境中直接提取總DNA，并克隆到載體PUC18上，構建環境基因組文庫；

(2)根據AdoHcyase基因序列設計引物，兩條引物分別為：

上游：5’-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3’

下游：5’-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3’

(3)應用如上所述引物，應用PCR方法從環境基因組DNA文庫中大量篩選克隆，擴增獲得1.2kb的AdoHcyase基因片段，并通過測序，確定獲得的片段具有如SEQ?ID.No.1所示核苷酸序列和SEQ?ID.No.2所示氨基酸序列；通過BLAST比對，與報道的嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus?acidocaldarius?DSM?639)的AdoHcyase基因具有98％的同源性；