[發(fā)明專(zhuān)利]基因工程菌、用其制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210027921.8
• 申請(qǐng)日: 2012-02-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102559572A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒炳德;鄒繼華;賈江花;章玉勝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 寧波美康生物科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N9/14;C12Q1/34;C12R1/19
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

1.一種基因工程菌，其特征在于：該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.5654，保藏日期：2011.12.26，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心；是通過(guò)PCR技術(shù)從環(huán)境基因組文庫(kù)中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，插入到含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子的PET28質(zhì)粒中，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，獲得高效表達(dá)AdoHcyase的基因工程菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ?ID.No.1所示核苷酸序列和由上述核苷酸序列編碼的如SEQ?ID.No.2所示的氨基酸序列。

3.一種利用權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法，其特征在于：該水解酶的制備步驟包括：

(1)將保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.5654，保藏日期：2011.12.26的基因工程菌接入到含有50～200mg/L卡拉霉素的2YT或LB液體培養(yǎng)基中，10～37℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.8時(shí)，然后加入終濃度為0.1～1.0mmol/L?IPTG誘導(dǎo)，10～37℃繼續(xù)培養(yǎng)18～32h；

或?qū)⒒蚬こ叹苯咏尤氲饺樘亲哉T導(dǎo)培養(yǎng)基中，乳糖含量為0.1～10％，10～37℃培養(yǎng)24～72h；

(2)將步驟(1)所得培養(yǎng)液于5000～10000rpm離心20～40min，收集菌體，加入菌體體積1～20倍、pH6.5～8.0的磷酸鹽緩沖液，破碎菌體；破碎后在10000～18000rpm離心20～50min，收集上清液，過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，用0～500mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；或者過(guò)疏水層析，用0～400mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；分部收集，回收含有酶活的部分；

(3)在收集含有酶活溶液中加入終濃度為0.1～5％的保護(hù)劑，然后置于-20℃預(yù)冷10～50h，再在-40～-60℃、30～100Pa下冷凍干燥24～72h，得到酶制劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的制備方法，其特征在于：步驟(3)中所述的保護(hù)劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、甘油中的一種或兩種。

5.一種權(quán)利要求1所述的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在L-同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。