[發(fā)明專利]無細胞百日咳疫苗的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210027499.6
• 申請日: 2012-02-08
• 公開（公告）號: CN103242434B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發(fā)明（設計）人: 王雪云;王長永;谷義平;徐艷艷;姜濤;曾紅;柏建力;崔善海;夏富文;王洪飛
• 申請（專利權）人: 長春百克生物科技股份公司
• 主分類號: C07K14/235
• 分類號: C07K14/235;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;A61K39/10;A61P31/04
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;胡洪慧

本發(fā)明涉及一種制備無細胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進行超濾濃縮處理，從而得到濃縮液；將所述濃縮液進行陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)；任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進行多結合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Prn)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進行硫酸銨沉淀和多結合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Prn)；將PT單獨制成無細胞百日咳疫苗，或者將PT同FHA和/或Prn混合在一起制成無細胞百日咳疫苗。

技術領域

本發(fā)明涉及百日咳疫苗的制備方法以及百日咳疫苗。更具體而言，本發(fā)明涉及百日咳有效抗原成分的分離純化、無細胞百日咳疫苗的制備方法和無細胞百日咳疫苗。

背景技術

百日咳疫苗是預防該病最有效、最經濟的手段，其包括全細胞百日咳疫苗(wholecell pertussis vaccine，WPV)和無細胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine，APV)。

全細胞百日咳疫苗于1914年首次研制成功，其是通過將細菌大量培養(yǎng)增菌后采用適宜的方法殺菌，使其滅活成無傳染性但具有良好免疫原性的百日咳全菌體，再加入佐劑制備而成。在控制和降低兒童百日咳發(fā)病方面，全細胞百日咳疫苗發(fā)揮了巨大作用，其優(yōu)點在于價格低，有效性已經確認，只要達到一定的接種覆蓋面，就可有效預防百日咳的流行。但該制品存在一些缺點：副反應較大，安全性還存在一定問題。

在這種情況下，日本于80年代率先研制并使用了以百日咳毒素(pertussistoxin，PT)和絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)為主要有效成分的無細胞百日咳疫苗。無細胞百日咳疫苗被認為是近二十年來疫苗學領域十大進展之一。

無細胞百日咳疫苗的主要成分有PT、FHA、粘附素(pertacin，Prn)、凝集原(agglutigogen，AGG)等。

PT：是百日咳桿菌致病的主要毒力因子，同時也是其所產生的諸多生物活性物質中唯一不受爭議的保護性抗原。在鮑特氏菌屬中，百日咳桿菌是唯一能產生PT的細菌。PT是由S1、S2、S3、S4和S5等5個亞單位以1∶1∶1∶2∶1的比例組成，相對分子質量為117×10³，為一個典型的“A-B核糖基轉移酶”模式的細菌毒素。A部分由毒性亞基構成，主要具有識別生物學活性的功能，PT的大部分酶活性是S1的作用，例如促淋巴細胞增多、激活胰島素細胞、簇集CHO細胞生長和組胺致敏等，而B部分由S2、S3、S4(2個)和S5組成，參與與真核細胞表面受體結合及毒性亞基的跨膜運輸。

FHA：是由鮑特氏菌屬百日咳桿菌產生的一種具有粘附作用的表面蛋白質分子，因對紅細胞有凝集作用而得名。FHA相對分子量為220×10³。FHA與百日咳桿菌粘附和定居在呼吸道器官的上皮細胞有關，也是百日咳桿菌致病的重要毒力因子，同時還具有較強免疫原性，能刺激機體免疫系統(tǒng)產生特異的保護性抗體。

Prn：是一種非纖毛性的凝集原，存在于百日咳桿菌表面，它在百日咳桿菌侵襲宿主呼吸系統(tǒng)上皮細胞的感染粘附過程發(fā)揮著重要的作用，也具有較強的免疫原性。

AGG：百日咳桿菌有8種AGG，其中6種是百日咳桿菌所特有的。百日咳桿菌以AGG1、2、3為主，其他幾種AGG為輔。研究證實AGG2和3在細菌感染過程中對宿主支氣管細胞有粘附作用，所以，AGG也是百日咳桿菌的致病因子之一。一些國家的臨床試驗報道，百日咳菌體疫苗中的效價與小鼠的免疫應答和疫苗對兒童的免疫保護性之間有著良好的相關性。因此，WHO推薦在百日咳疫苗生產中應選用含有2、3型AGG的菌株，目前世界上一些國家生產的無細胞百日咳疫苗中含有AGG2或3，或者兩者均有。

無細胞百日咳疫苗是通過純化工藝，提取細菌中具有免疫原性的抗原成分，去除無免疫原性并且引起不良反應的毒性物質制備而成的。