[發明專利]無細胞百日咳疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201210027499.6
• 申請日: 2012-02-08
• 公開（公告）號: CN103242434B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 王雪云;王長永;谷義平;徐艷艷;姜濤;曾紅;柏建力;崔善海;夏富文;王洪飛
• 申請（專利權）人: 長春百克生物科技股份公司
• 主分類號: C07K14/235
• 分類號: C07K14/235;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;A61K39/10;A61P31/04
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;胡洪慧

1.一種從百日咳桿菌培養上清液分離純化百日咳有效抗原成分的方法，所述方法包括以下步驟：

1)將百日咳桿菌培養上清液進行切向流超濾濃縮處理，從而得到濃縮液；

2)對所述濃縮液進行CM-Sepharose陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素和絲狀血凝素；

3)將在步驟2)中得到的流穿液進行多結合性Capto-adhere柱陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素；

其中，所述百日咳毒素的洗脫是用pH為7.4-7.6的0.5-2M尿素+20-50mM Tris-HCl緩沖液進行的；所述絲狀血凝素的洗脫是用pH為7.0-8.0的0.2-0.6M氯化鈉+20-50mM磷酸鹽緩沖液進行的；并且所述多結合性Capto-adhere柱陰離子交換層析中，百日咳粘著素是用以下溶液連續洗脫獲得的：i)5-10mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.6-7.5；ii)0.5-1M NaCl磷酸鹽緩沖液，pH 6.6-7.5；和iii)5-10mM醋酸鉀緩沖液，pH 4.0-5.0。

2.一種制備無細胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括：

1)將百日咳桿菌培養上清液進行切向流超濾濃縮處理，從而得到濃縮液，其體積為初始體積的1％至10％；

2)將所述濃縮液進行CM-Sepharose陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素和絲狀血凝素；

3)將在步驟2)中得到的流穿液進行多結合性Capto-adhere柱陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素，以及將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進行硫酸銨沉淀和多結合性Capto-adhere柱陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素；

4)將百日咳毒素單獨制成無細胞百日咳疫苗，或者將百日咳毒素同絲狀血凝素和/或百日咳粘著素混合在一起制成無細胞百日咳疫苗；

其中，所述百日咳毒素的洗脫是用pH為7.4-7.6的0.5-2M尿素+20-50mM Tris-HCl緩沖液進行的；所述絲狀血凝素的洗脫是用pH為7.0-8.0的0.2-0.6M氯化鈉+20-50mM磷酸鹽緩沖液進行的；并且所述多結合性Capto-adhere柱陰離子交換層析中，百日咳粘著素是用以下溶液連續洗脫獲得的：i)5-10mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.6-7.5；ii)0.5-1M NaCl磷酸鹽緩沖液，pH 6.6-7.5；和iii)5-10mM醋酸鉀緩沖液，pH 4.0-5.0。

3.權利要求2的方法，其中步驟1)中的濃縮液體積為初始體積的4％至7％。

4.權利要求1-3任一項的方法，其中將所述絲狀血凝素進一步進行Sephacryl S-200High Resolution柱層析。

5.權利要求1-3任一項的方法，其中將在步驟2)中得到的流穿液事先進行硫酸銨沉淀處理。

6.權利要求2或3的方法，其中將所述百日咳毒素脫毒。

7.權利要求6的方法，其中使用戊二醛或甲醛進行百日咳毒素脫毒。

8.權利要求7的方法，所述脫毒過程包括：使所述50-200μg/ml百日咳毒素與0.5％-1.5％戊二醛室溫作用4-8小時，隨后加入L-賴氨酸使其終濃度為0.01-0.02M，再在室溫下作用2-4小時，終止反應。

9.權利要求6的方法，其中在脫毒過程中加入保護劑和/或分散劑。

10.權利要求9的方法，其中所述保護劑為賴氨酸、甘氨酸或天冬氨酸，所述分散劑為吐溫20或吐溫80。

11.權利要求2或3的方法，其中，在步驟4)中，相對于3重量份百日咳毒素，絲狀血凝素為0-3重量份，百日咳粘著素為0-3重量份。

12.權利要求11的方法，其中所述抗原百日咳毒素、絲狀血凝素和百日咳粘著素的混合比例為3:3:1至3:3:3。