[發明專利]用于純化高分子量透明質酸的有效方法

有效

• 申請號: 201210027481.6
• 申請日: 2007-07-06
• 公開（公告）號: CN102617754A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: V·蘭加斯瓦米;V·桑托什;J·達門德拉;V·納塔拉;H·維蘭卡;A·卡帕特
• 申請（專利權）人: 利萊恩斯生命科學有限公司
• 主分類號: C08B37/08
• 分類號: C08B37/08;C12P19/04;C12R1/46
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;劉健

1.從細菌發酵液純化透明質酸(HA)或它的鹽的方法，包含：

(a)稀釋和澄清發酵液；

(b)用等體積的溶劑沉淀在發酵液中存在的HA；

(c)將沉淀的HA或它的鹽溶于溶液；

(d)將硅膠加入來自步驟(c)的HA溶液或HA鹽溶液，然后去除硅膠；

(e)用活性炭處理來自步驟(d)的HA溶液或HA鹽溶液；和

(f)使用約5體積的溶劑，滲濾來自步驟(e)的HA溶液或HA鹽溶液；

其中在沒有任何去污劑或表面活性劑或福爾馬林存在下和在中性pH進行該方法。

2.根據權利要求1的方法，其中：

(a)在步驟(b)中沉淀的HA轉化成它的鹽，然后在步驟(c)的溶液中均化HA鹽；和/或

(b)在步驟(c)中的溶液是3％乙酸鈉；和/或

(c)在步驟(d)中通過離心去除硅膠；和/或

(d)在步驟(e)中將活性炭浸漬在纖維素筒上；和/或

(e)在步驟(f)中的溶劑是無菌的無致熱原水。

3.根據權利要求1的方法，其中在步驟(b)中使用的溶劑選自異丙醇、乙醇和丙酮。

4.根據權利要求3的方法，其中所述溶劑是異丙醇。

5.權利要求1的方法，另外包含：

(g)通過無菌過濾器過濾，分離無菌的、純化的HA或它的鹽；和

(h)凍干HA或它的鹽，直到水分含量小于5％。

6.根據權利要求1的方法，其中步驟(b)的溶劑是異丙醇，且該方法另外包含(g)凍干HA或它的鹽，直到水分含量小于5％。

7.權利要求1-6的任一項的方法，其中所述發酵液是通過包含以下步驟的方法獲得的：

(i)提供能生產HA的細菌；

(ii)提供營養培養基來培養細菌，其中所述營養培養基包含二價金屬離子鹽、1％酪蛋白水解物和5％選自乳糖和蔗糖的碳源；

(iii)在營養培養基中培養細菌；和

(iv)在需氧條件下發酵營養培養基，

其中所述透明質酸具有至少100萬Da的分子量。

8.權利要求7的方法，其中：

(a)發酵是連續的；和/或

(b)所述二價金屬離子鹽選自MgSO₄、CuSO₄、MnSO₄和ZnSO₄；和/或

(c)在30-40℃的溫度、300-500rpm的攪拌速率、1-3vvm的通氣和中性pH，進行所述發酵步驟至少15個小時；和/或

(d)所述HA具有在約3.5x10⁶Da至4.0x10⁶Da范圍內的分子量，且該方法生產產量為至少5g高分子量HA/升營養培養基；和/或

(e)所述細菌選自：獸瘟鏈球菌、馬鏈球菌和釀膿鏈球菌。

9.權利要求8的方法，其中所述鹽是ZnSO₄。

10.權利要求9的方法，其中發酵24小時后，HA的分子量是至少3x10⁶Da。

11.權利要求8的方法，其中所述細菌是獸瘟鏈球菌。

12.權利要求1的方法，其用于生產透明質酸(HA)或它的鹽，該方法包含：

(a)提供能生產HA的細菌；

(b)提供營養培養基來培養微生物源，其中所述營養培養基包含二價金屬離子鹽、1％酪蛋白水解物和5％選自乳糖和蔗糖的碳源；

(c)在營養培養基中培養細菌；

(d)在需氧條件下發酵營養培養基；

(e)稀釋和澄清營養培養基；

(f)用溶劑沉淀在稀釋的培養基中存在的HA；

(g)將沉淀的HA或它的鹽溶于溶液；

(h)將硅膠加入來自步驟(g)的HA溶液或HA鹽溶液，然后去除硅膠；

(i)用活性炭處理來自步驟(h)的HA溶液或HA鹽溶液；和

(j)使用溶劑滲濾來自步驟(i)的HA溶液或HA鹽溶液；

其中在沒有任何去污劑或表面活性劑或福爾馬林存在下和在中性pH進行該方法；

其中所述HA具有至少100萬Da的分子量。

13.生產透明質酸(HA)或它的鹽的方法，該方法包含：

(a)提供能生產HA的細菌；

(b)提供營養培養基來培養細菌，其中所述營養培養基包含鋅、濃度為10g/L的酪蛋白水解物和濃度為50g/L的選自乳糖和蔗糖的碳源；

(c)在營養培養基中培養細菌；和

(d)在需氧條件下發酵營養培養基，

其中所述透明質酸具有至少100萬Da的分子量。