[發(fā)明專(zhuān)利]腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210025957.2
• 申請(qǐng)日: 2012-02-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102585003B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃明東;周山勇;陳卓;陳錦燦;胡萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/30
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/30;C07K1/107;A61K41/00;A61K47/68;A61P35/00
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11535
• 代理人: 劉元霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥、生物技術(shù)、化學(xué)、免疫生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)越來(lái)越多地報(bào)道了一種新的腫瘤治療方法——光動(dòng)力療法(PDT)。腫瘤光動(dòng)力療法是現(xiàn)代腫瘤微創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)治療領(lǐng)域的最新進(jìn)展，于1996年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，并在美國(guó)、日本、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、加拿大等國(guó)用于多種腫瘤治療取得成功。2003年5月中國(guó)SFDA批準(zhǔn)了這一治療系統(tǒng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。

光動(dòng)力療法是一種正在發(fā)展中的治療惡性腫瘤的新型治療手段，臨床上已用于多種腫瘤的治療。為了增加光動(dòng)力療效，我們選用能與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的單克隆抗體為載藥工具，將光敏劑與抗體共價(jià)偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的光敏免疫偶聯(lián)物，由抗體進(jìn)行導(dǎo)向，使光敏劑與特定腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合，達(dá)到靶向給藥的目的，提高治療的依從性。

光動(dòng)力治療是一種很有前景的腫瘤治療方法，在臨床上已經(jīng)被運(yùn)用于頭頸部腫瘤、食管癌、乳腺癌、基底細(xì)胞癌等多種腫瘤的治療，但是目前的光動(dòng)力治療的藥物仍存在一些不足，如：光敏劑對(duì)腫瘤的選擇性差；存在光毒性反應(yīng)，治療后病人避光時(shí)間長(zhǎng)。為了克服這些不足，人們開(kāi)始進(jìn)行了光免疫治療的研究，達(dá)到靶向給藥的目的。

光免疫治療是指將光敏劑與單克隆抗體通過(guò)化學(xué)方法聯(lián)接，制備出光敏免疫偶聯(lián)物，旨在選擇性的將光敏劑運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位，使腫瘤部位的光敏劑濃度增高，減少用量，提高療效，同時(shí)，由于皮膚對(duì)大分子物質(zhì)滲透性差，也可以降低光毒性反應(yīng)，縮短避光時(shí)間。1983年加拿大的Mew.D等首先報(bào)道了血卟啉與單克隆抗體的交聯(lián)物對(duì)靶細(xì)胞具有殺傷作用。在國(guó)內(nèi)，制備血卟啉一抗體偶聯(lián)物已有先例，劉建源等將血卟啉衍生物與抗CEA單抗制成免疫偶聯(lián)物，腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合的單抗與光敏劑偶聯(lián)，使得光敏劑通過(guò)單抗的導(dǎo)向作用到達(dá)腫瘤組織的劑量增加、滯留時(shí)間延長(zhǎng)且吸收增加，并且副作用減少。

酞菁及其衍生物以其良好的光熱穩(wěn)定性、強(qiáng)的紅外吸收、和較強(qiáng)的光動(dòng)力效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，成為新一代光敏劑中的佼佼者。本項(xiàng)發(fā)明主要利用一種單取代酞菁鋅與靶向腫瘤的單克隆抗體制備光敏免疫偶聯(lián)物，提高光動(dòng)力治療的靶向特異性，以增加該光敏劑的選擇性，同時(shí)也減少它對(duì)正常細(xì)胞的毒性。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N高活性的酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法及其抗腫瘤應(yīng)用的技術(shù)方法(圖1)，所制備的光敏免疫偶聯(lián)物具有成本低、穩(wěn)定性好、抗腫瘤活性高等特點(diǎn)。

一、本項(xiàng)發(fā)明所用的單克隆抗體是具有如下特征的單克隆抗體：

1)分子量：150-170KDa；2)吸光特性：280nm具有特征吸收峰；3)生物學(xué)特性：?jiǎn)慰寺】贵w，能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面生長(zhǎng)因子受體，并與之發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。4)本項(xiàng)發(fā)明所述的單克隆抗體包括曲妥珠單抗(Herceptin)、西妥昔單抗(cetuximab)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)等能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體。

二、酞菁鋅-單克隆抗體腫瘤靶向光敏免疫偶聯(lián)物的制備方法如下：

1)水溶性單羧基酞菁鋅酰肼衍生物的制備，以已公開(kāi)的“一種廣譜、低毒性的酞菁類(lèi)殺菌劑及其制備方法和用途”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?00510107773)所提及的一種新型酞菁類(lèi)光敏劑，即單羧基取代酞菁鋅(ZnPc-COOH)為基礎(chǔ)，將單羧基取代酞菁鋅與表面帶有五聚賴(lài)氨酸(5K)的樹(shù)脂反應(yīng)，再用水合肼肼解，脫去保護(hù)基，形成水溶性單羧基酞菁鋅酰肼衍生物(ZnPC-CO-5K-NHNH2)。本項(xiàng)發(fā)明利用水溶性單羧基酞菁鋅酰肼衍生物與單克隆抗體共價(jià)偶聯(lián)，目前在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有此化合物的相關(guān)報(bào)道。

2)抗體氧化：?jiǎn)慰寺】贵w在PH7.2的磷酸鹽緩沖液中，加入終濃度10mM的高碘酸鈉，25℃氧化30min后，加入終濃度10mM的抗壞血酸，將殘留的高碘酸鈉徹底還原成碘離子，防止殘留的高碘酸鈉氧化將要偶聯(lián)的酞菁鋅，本發(fā)明利用抗壞血酸還原高碘酸鈉，這種做法目前在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有此化合物的相關(guān)報(bào)道。

3)將氧化后的單克隆抗體與ZnPC-CO-5K-NHNH2偶聯(lián)，取氧化后的單克隆抗體與單羧基酞菁鋅酰肼衍生物按摩爾比1∶10，溶于在PH7.2的磷酸鹽緩沖液中，混勻，4℃冰箱避光渦旋震蕩過(guò)夜后，加入還原劑，4℃冰箱，反應(yīng)4h，形成穩(wěn)定偶聯(lián)物。本發(fā)明在中性的水溶液中完成抗體與酞菁鋅的偶聯(lián)，最大程度的保存抗體的活性，這種做法目前在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有此化合物的相關(guān)報(bào)道。