[發明專利]一株分泌抗2型豬鏈球菌的型特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其制備方法

無效

• 申請號: 201210023353.4
• 申請日: 2012-02-02
• 公開（公告）號: CN102533667A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 潘秀珍;唐家琪;王長軍;李先富;王忠燦
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;C12R1/91
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 夏平

技術領域

本發明屬于病原微生物免疫學檢測技術領域，涉及一株分泌抗2型豬鏈球菌的型特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其制備方法。

背景技術

2型豬鏈球菌(Streptococcus?suis?serotype?2，SS2)是一種重要的人畜共患病的病原體。根據莢膜多糖的抗原性，SS可分為35個血清型，其中1、2、1/2、7、9、14型具有致病性，以2型(SS2)致病性最強。同為SS2菌株，其致病性又有強、弱和無之分。SS2疫病流行范圍很廣，在加拿大、美國、丹麥、荷蘭等國曾多次發生流行。我國于1991年首次在廣東省豬群中發生疫情，20多年來在湖北、湖南、江蘇、江西、安徽、四川等南方省份的豬群中經常有此病流行，目前已形成和維持著多處疫源地，在適宜氣候和環境條件下存在大規模暴發流行的可能。豬群對此病普遍易感，感染后可有急性敗血癥、肺炎、腦膜炎、關節炎、心內膜炎及急性死亡等多種臨床類型，如不及時治療病死率可達40％甚至更高；病后幸存的豬生長緩慢，存欄時間大為延長。目前在我國，豬鏈球菌感染每年造成的直接經濟損失達數十億元。特別值得關注的是，近年來我國發生的兩起SS2暴發流行感染豬和人的公共衛生事件：1998年江蘇病死豬10萬余頭，人群感染25例，其中中毒性休克綜合征(Streptococcal?toxic?shock?syndrome，STSS)患者16例，死亡13例(81.3％)；2005年四川省30余鄉鎮養殖的豬場流行該病，死亡豬幾千頭，人群感染204例，其中STSS型患者38例，死亡37例(97.4％)。同期廣東、香港也有病例報導，江蘇雖無人感染病例，但豬群流行此病，病死8萬余頭。與以往國際報導比較，這兩次流行有以下特點：國外人感染病例均為散發，我國則呈現群體染病特點；國外病例臨床表現為敗血癥或腦膜腦炎，預后較好，國內這兩次流行有高比例的病人出現STSS，病程短，病情兇險，病死率高(81.3％～97.4％)。引起此次疫情的病原是具有莢膜多糖(capsular?polysaccharide，CPS)、溶菌酶釋放蛋白(muramidase?releasedprotein，MRP)、胞外因子(extracellular?factor，EF)、溶血素(suilysin，SLY)等毒力蛋白的2型豬鏈球菌強毒株，但致病機理尚不明確。

單克隆抗體是研究細菌毒力因子的有用工具，國外研究者用抗B群鏈球菌，腦膜炎奈瑟菌和大腸桿菌莢膜的單抗進行動物保護性實驗并能取得較好的效果。單克隆抗體對許多疾病的診斷和治療都具有十分重要的意義。但細菌的表面抗原很豐富，做出的單抗常常有交叉反應，不能很專業的識別一種細菌。從目前的國內外的研究來看，豬鏈球菌的單抗也存在這種問題，只有靠預吸附其他鏈球菌來克服交叉問題。

發明內容

本發明的目的是為了克服上述技術中存在的不能克服交叉反應的缺陷，提供一株抗2型豬鏈球菌的型特異性單克隆抗體細胞株。

本發明的另一目的是提供該雜交瘤細胞的制備方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一株分泌抗2型豬鏈球菌的型特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株2A9，該雜交瘤細胞株通過如下方法制備：

(1)采用滅活的2型豬鏈球菌菌株O5ZYH33多次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠體內抗體達到最高峰時分離脾臟B淋巴細胞；

(2)將步驟(1)分離的脾臟B淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合；

(3)以甲醛滅活的O5ZYH33全菌抗原包被ELISA板，使用全菌ELISA篩選陽性克??；再進一步以全菌裂解液為抗原用Western?blot法再次驗證ELISA篩選得到的陽性克隆，最終獲得雜交瘤細胞株2A9。

其中，步驟(1)優選：選用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛滅活的O5ZYH33分離株為免疫原，注射菌量為10⁷cfu/只鼠，間隔2周追加免疫共3次，在融合前3天加強免疫一次，菌量為10⁸cfu/只鼠。

一種制備分泌抗2型豬鏈球菌的型特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株的方法，包含如下步驟：

(1)采用滅活的2型豬鏈球菌菌株O5ZYH33多次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠體內抗體達到最高峰時分離脾臟B淋巴細胞；

(2)將步驟(1)分離的脾臟B淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合；