[發明專利]一種草莓抗連作障礙突變體的篩選方法

有效

• 申請號: 201210021686.3
• 申請日: 2012-01-31
• 公開（公告）號: CN103053415A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 甄文超;劉雪靜;齊永志;馬燕會;代麗
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種利用草莓枯萎病菌尖孢鐮刀菌毒素和自毒物質對羥基苯甲酸混合液作為選擇壓力誘導篩選草莓抗連作障礙突變體的方法。?

背景技術

草莓受連作障礙影響非常嚴重，自毒物質和土壤病原微生物均是導致草莓連作障礙的重要原因。目前，有關作物的化感作用已日益受到越來越多的關注，并且圍繞根系化感物質的自毒作用研究更是成為國內外學者探尋連作障礙發生根本原因熱點。自毒作用是指一種作物或微生物以自然揮發、雨霧淋溶、根系分泌和植物分解等方式向環境中釋放次生代謝物質而影響周圍或鄰近的植物、動物、微生物的生長發育產生的有害的化學生態學現象，這些次生代謝物質稱為自毒物質。草莓根系分泌物和腐解物中的對羥基苯甲酸是其主要自毒物質之一，常年連作使其含量在土壤中逐年積累，進而抑制了草莓的生長發育，降低了根系活性和抗病性，最終致使枯萎病的嚴重發生。?

草莓根際土壤中的病原微生物主要包括三類，分別是尖孢鐮刀菌（Fusarium?oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani）和大麗輪枝菌（Verticillium?dahliae），但以常導致枯萎病發生的尖孢鐮刀菌為主；該病菌是屬于土傳病原菌，生產上很難進行防治。植物病原菌毒素是病原菌產生的對寄主植物有毒性的代謝產物，是導致植物病害發生的主要原因之一。以病原菌產生的致病毒素作為選擇壓力，在離體條件下進行抗病突變體的篩選，是抗病性離體選擇體系中發展比較成熟、應用較為成功的一種技術體系。據統計，已有17種作物50余種病害的突變體問世，是微生物化育種技術中獲得抗性新材料或品系數較廣泛的。研究者郭麗娟等（郭利娟等,誘發玉米抗小斑病突變體的研究,從玉米單倍體胚性細胞無性系篩選抗小斑病突變,遺傳學報,1981,14(5):17-20）研究了玉米抗小斑病突變體，以玉米小斑病菌產生的致病毒素為選擇壓力，在短期內離體誘發和篩選抗玉米小斑病的突變體。趙明敏等（趙明敏等,利用病原真菌毒素離體篩選茄子抗黃萎病突變體的研究,華北農學報,2006,?21(1):92-95）以茄子黃萎病菌毒素作選擇劑，離體篩選茄子抗黃萎病突變體，其愈傷組織均能夠較好的表達植株水平的抗性。?

諸多研究者所使用的試材不同，離體篩選時誘導時間和培養基的不同，測定的不定芽半致死劑量差異也很大。迄今為止，關于草莓抗枯萎病突變體的誘導和篩選還缺乏系統研究，該技術也未成熟和程序化。本發明以草莓組培苗葉片為試材，以病原菌毒素和自毒物質混合物作為選擇壓力進行誘變處理，離體篩選草莓抗性突變體。根據不同培養基對葉片愈傷組織誘導的影響，建立了離體葉段愈傷組織最優再生體系；同時確定了毒素和自毒物質混合液的半致死劑量。本發明中抗性突變體的成功篩選對解決草莓生產中連作障礙問題具有重要的理論和實踐意義。此處鍵入背景技術描述段落。?

發明內容

本發明目的在于提供一種利用病原真菌毒素和自毒物質混合液離體篩選草莓抗枯萎病突變體的方法，其以草莓組培苗葉段為誘導材料，在最優再生體系條件下，以尖孢鐮刀菌毒素和對羥基苯甲酸混合液的半致死劑量為選擇壓力，研究愈傷組織生長、分化和遺傳穩定的特性，通過再生植株接種病原菌和澆灌對羥基苯甲酸處理，調查其生長發育指標、根系病情指數和結實性，最終建立以毒素和自毒物質混合液誘變篩選草莓抗枯萎病突變體的方法。?

技術方案?：?

1、建立離體葉段愈傷組織最優再生體系　剪取草莓組培苗4×4mm葉段，接種于不同MS固體誘導培養基，光照培養（25℃,?3000LUX,?14h/d）50d后，根據愈傷組織誘導率和發生量，建立草莓離體葉段愈傷組織最優再生體系。

2、無菌毒素原液的配制　在生長于PDA平板上的尖孢鐮刀菌菌落邊緣切取φ為5mm的菌餅，無菌條件下轉接到裝有150mL?Czpek's培養液的三角瓶中，每瓶5枚菌餅；震蕩培養（25℃，110r/min）21d后，4000r/min離心30min；用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾得無菌毒素原液。?