[發明專利]對蝦傳染性肌肉壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210021437.4
• 申請日: 2012-01-31
• 公開（公告）號: CN102559484A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 閆冬春;劉鴻玲
• 申請（專利權）人: 魯東大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 煙臺雙聯專利事務所(普通合伙) 37225
• 代理人: 矯智蘭

技術領域

本發明涉及對蝦傳染性肌肉壞死病毒的檢測試劑盒及檢測方法，屬于海洋生物病原檢測技術領域。

背景技術

傳染性肌肉壞死病為2002年在巴西發現的一種危害對蝦生產的新的病毒性傳染病，2004年美國亞利桑納大學Lightner?D?V博士研究發現該病由一種新的病毒引起并將之定名為傳染性肌肉壞死病毒（Infectious?myonecrosis?virus,簡稱IMNV）。這種新型病毒為雙鏈RNA病毒，屬于整體病毒科。對蝦傳染性肌肉壞死病毒的易感對蝦種類為南美白對蝦，主要是感染60-80天的幼蝦。該病毒能造成染病對蝦全身肌肉組織壞死，一般情況下，病理死亡發生緩慢，死亡率不高，但整個養殖過程都有死亡，累積死亡率可達70%。該病毒目前已傳入亞洲，正威脅著中國的南美白對蝦養殖。

Andrade?T?P?D等2007年建立了IMNV的熒光定量PCR檢測方法，最低可檢測到10拷貝的IMNV，此檢測方法靈敏度有待進一步提高。因熒光定量PCR檢測方法是進行對蝦病毒定量及早期預防的重要有效手段，所以建立高靈敏度的熒光定量PCR檢測方法，以及配合該檢測方法使用的病毒檢測試劑盒極為重要。

發明內容

本發明的目的在于解決現有熒光定量PCR檢測方法中存在的靈敏度不高的問題，提供對蝦傳染性肌肉壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，同時還提供了利用該試劑盒進行檢測的檢測方法，該檢測方法靈敏、特異，便于操作。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

對蝦傳染性肌肉壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，包括盒體1，盒體1內設有管孔支架5，其特殊之處在于管孔支架5上擺放有以下管件：

（1）、熒光定量PCR?反應液管6，內裝2×熒光定量PCR?buffer、對蝦傳染性肌肉壞死病毒正反引物及熒光標記的TaqMan探針的混合液；

正向引物序列：5’-?GATGG?CAGCA?CGTCA?AAATG?-3’?；

反向引物序列：5’-?CAGCT?GTTCC?TGGGA?CTTCC?T?-3’?；

TaqMan探針序列：5’-CTATT?TCCTC?CACTA?ATTCA?GAGC-3’，探針序列的5’端用FAM?標記，3’端用TAMRA標記；

（2）、去離子水管3，內裝無菌去離子水；

（3）、陰性對照管4，內裝SPF（無特定病原體）對蝦核酸；

（4）、標準品管2，分別內裝傳染性肌肉壞死病毒10⁷,10⁶,?10⁵,?10⁴,?10³,?10²,?10,1拷貝cDNA陽性克隆。

對蝦傳染性肌肉壞死病毒熒光定量PCR檢測方法如下：

（1）熒光定量PCR反應體系：