[發明專利]反向斑點雜交基因芯片及其制造方法

無效

• 申請號: 201210021341.8
• 申請日: 2012-01-31
• 公開（公告）號: CN102676646A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 康熙雄;周建新;劉志忠;王強;石廣志
• 申請（專利權）人: 康熙雄;周建新;劉志忠;王強;石廣志
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C40B50/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及醫學體外診斷技術領域，具體地講是一種基因芯片，尤其是一種用于術后顱內感染快速診斷的反向斑點雜交基因芯片及其制造方法，在芯片上設置多種細菌的探針，其中包括開顱手術后患者腦脊液中一些常見病原菌，利用PCR擴增產物進行雜交試驗檢測、鑒定測試樣本。

背景技術

目前臨床實驗室采用的傳統細菌培養鑒定主要依靠表型鑒定，敏感性低，檢測周期長，且受抗生素應用、病原菌自身生理條件等各方面的限制，不能滿足臨床快速診斷的要求。而且，這種方法的準確性也有一定差異。如常引起院內感染爆發流行的鮑曼不動桿菌，從表型上與醋酸鈣不動桿菌、未正式命名的菌種3，13TU難以區分，依賴目前現有的商品化表型鑒定系統均難以區分。臨床病例還存在合并多種細菌感染的可能，這也對傳統細菌培養鑒定方法提出了挑戰。

細菌核糖體RNA(rRNA)是細菌生命的標志，其16s?rRNA和23s?rRNA基因是以多拷貝形式存在于所有細菌染色體基因中。目前對細菌16s?rRNA和23s?rRNA基因間區的研究較多，特別是將其應用于細菌的檢測。國外20世紀90年代初即有關于利用細菌16s?rRNA基因結構特點構建基因芯片，并將其應用于細菌鑒定的報道。該技術以其高通量、快速、準確性高等優點為解決上述問題提供了一條新的途徑，對流行病學和臨床狀況的認知有提高作用。

近年來，國內有人致力于寡核苷酸芯片技術用于臨床細菌檢測的研究，該種芯片以硝酸纖維膜和尼龍膜等不同載體和地高辛、膠體金顯色等方法制備。畢春霞等開展了16S?rRNA微型寡核苷酸芯片檢測腦脊液病原菌研究，但存在臨床常見腦脊液致病菌覆蓋不全、雜交時間長等不足，特別是缺少大樣本臨床驗證數據。這可能大大限制了其臨床應用價值。

目前市場上最主要的基因芯片產品是以點樣等方法制備的用于基因表達檢測的中、低密度基因芯片。基因芯片的一個重要發展趨勢是芯片制備、樣品處理、雜交、檢測以及數據分析的標準化，提高基因芯片的準確性和可靠性。基因芯片技術，無論其反應條件、檢測項目、數據分析較單一項目的分析都更為復雜化，而臨床檢驗要求檢測結果更為精確，因此，如何即保證檢測高通量，又保證性能優越，是芯片技術的瓶頸問題之一。

發明內容

考慮到至少一個上述問題而完成了本發明。具體地，本發明的目的是提供一種用于開顱手術后患者腦脊液中病原菌快速篩查的基因芯片及其制造方法。本發明包括了用于病原體基因檢測進行鑒定種、屬特異性探針和革蘭氏陰性細菌通用探針、革蘭氏陽性細菌通用探針，具有快速、靈敏的特點，是現有細菌鑒定技術的巨大突破。

具體地，一種用于開顱手術后患者腦脊液中病原菌快速篩查的基因芯片，其特征在于包括在基質上設置的革蘭氏陽性細菌通用探針、革蘭氏陰性細菌通用探針、以及鑒定細菌的種、屬特異性的探針，其中革蘭氏陽性細菌通用探針的核苷酸序列為GGTGGTGCATGGTTGTCGTCA，革蘭氏陰性細菌通用探針的核苷酸序列為GGTGCTGCATGGCTGTCGTCA；所述鑒定細菌的種、屬特異性的探針至少一個選自：

本發明針對每種所鑒定細菌種/屬的探針有著合理的堿基成分，探針的退火溫度在42-43℃之間，相對比較均一，即10種探針和對應的PCR產物雜交時最適宜的溫度條件基本一致，有利于在同一雜交溫度下的同步性，不會因為溫度的問題而影響雜交的結果，使檢查的準確性大大增加。

根據本發明另一方面，該基因芯片還包括標記有生物素點的DNA序列(Bio)ATGTCGCATCTGCGTTGGAATC。

根據本發明另一方面，提供了一種用于開顱手術后患者腦脊液中病原菌快速篩查的試劑盒，其特征在于包括前述的基因芯片以及各種引物，所述各種引物用于擴增臨床樣本中的DNA序列，包括：

擴增革蘭氏陰性菌的上游引物????ACTCCTACGGGAGGCAGCA

擴增革蘭氏陰性菌的下游引物????ATTACCGCGGCTGCTGGC

擴增革蘭氏陽性菌的上游引物????TGCCTTTGTAGAATGAACC

擴增革蘭氏陽性菌的下游引物????CTAAAGCTATTTCGGAGAGA。

根據本發明另一方面，提供了一種前述基因芯片的制備方法，包括如下步驟：

DNA探針的制備：合成與待測菌種DNA互補的5’末端經過胺基化的DNA片段，從細菌16S或23S核糖體RNA基因區中挑選出特定的序列，然后根據堿基互補特點，設計并合成出5’末端經過胺基化的DNA片段；