[發明專利]反向斑點雜交基因芯片及其制造方法

無效

• 申請號: 201210021341.8
• 申請日: 2012-01-31
• 公開（公告）號: CN102676646A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 康熙雄;周建新;劉志忠;王強;石廣志
• 申請（專利權）人: 康熙雄;周建新;劉志忠;王強;石廣志
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C40B50/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于開顱手術后患者腦脊液中病原菌快速篩查的基因芯片，其特征在于包括在基質上設置的革蘭氏陽性細菌通用探針、革蘭氏陰性細菌通用探針、以及鑒定細菌的種、屬特異性的探針，其中革蘭氏陽性細菌通用探針的核苷酸序列為GGTGGTGCATGGTTGTCGTCA，革蘭氏陰性細菌通用探針的核苷酸序列為GGTGCTGCATGGCTGTCGTCA；所述鑒定細菌的種、屬特異性的探針至少一個選自：

2.根據權利要求1所述的基因芯片，其特征在于還包括標記有生物素點的DNA序列(Bio)ATGTCGCATCTGCGTTGGAATC。

3.一種用于開顱手術后患者腦脊液中病原菌快速篩查的試劑盒，其特征在于包括權利要求1或2所述的基因芯片、以及各種引物，其中所述各種引物用于擴增臨床樣本中的DNA序列，包括：

擴增革蘭氏陰性菌的上游引物????????ACTCCTACGGGAGGCAGCA

擴增革蘭氏陰性菌的下游引物????????ATTACCGCGGCTGCTGGC

擴增革蘭氏陽性菌的上游引物????????TGCCTTTGTAGAATGAACC

擴增革蘭氏陽性菌的下游引物????????CTAAAGCTATTTCGGAGAGA。

4.一種權利要求1或2所述的基因芯片的制備方法，包括如下步驟：

DNA探針的制備：合成與待測菌種DNA互補的5’末端經過胺基化的DNA片段，從細菌16S或23S核糖體RNA基因區中挑選出特定的序列，然后根據堿基互補特點，設計并合成出5’末端經過胺基化的DNA片段；

固定探針：將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上，先對尼龍膜進行活化處理，然后將探針點到膜上，通過探針末端的胺基與活化膜上的羧基形成共價結合，牢固的將探針固定在膜上；

制備基因芯片：利用氫氧化鈉停止反應，制得基因芯片。

5.一種權利要求3所述的試劑盒的制備方法，用于鑒定開顱手術后患者腦脊液中病原菌，包括以下步驟：

設計病原體特異性探針：選擇細菌的16S和23S核糖體RNA基因為靶序列，從中選取種、屬特異性和通用序列探針，序列號為SEQ?ID?No.1-10；

標記有生物素點的DNA序列，序列為SEQ?ID?No.11；

各種引物，用于擴增臨床樣本中的DNA序列，其序列分別為SEQ?ID?No.12、SEQ?ID?No.13、SEQ?ID?No.14、SEQ?ID?No.15；

探針處理：在5’末端經過胺基化處理，使其能夠固化在尼龍膜上；

固定探針：將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上；

基因芯片的制備：使用點樣儀在尼龍膜上按預先設定好的順序進行點樣。

6.一種權利要求3所述的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

利用試劑盒中含有特定序列的引物PCR擴增臨床樣本中的DNA；

對擴增后的DNA進行雜交；

檢測基因芯片上結合的DNA。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于具體包括以下步驟：

第一步：擴增樣品

將臨床樣本中提取的DNA通過PCR反應進行擴增，所用引物的5’端標記有生物素，擴增得到5’端帶有生物素標記的DNA產物；

第二步：雜交

將上述擴增得到的DNA與基因芯片上面分布的DNA探針、Bio進行反應

第三步：顯色

在堿性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIT系統顯色，肉眼直接觀察結果。