[發明專利]一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞樣本密度分離液及干細胞分離方法

有效

• 申請號: 201210017987.9
• 申請日: 2012-01-19
• 公開（公告）號: CN102604892A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 唐明淇
• 申請（專利權）人: 唐明淇
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789
• 代理公司: 北京思創畢升專利事務所 11218
• 代理人: 韋慶文

1.一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞樣本密度分離液，其特征在于：

所述的干細胞樣本密度分離液分別由1號液、2號液和3號液組成，按照重量百分比計，其各自組份的含量為：

1號液為稀釋劑，選自下列水溶液之一：0.1-30％氯化鈉注射液和0.1-20％的腦蛋白水解物組成的水溶液、或者0.1-30％的pH為7-7.5的磷酸鹽緩沖液和0.1-20％的腦蛋白水解物組成的水溶液；

2號液為沉淀劑，選自0.1-30％羥乙基淀粉水溶液或0.1-30％甲基纖維素水溶液；

3號液為分層液，其為密度為1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。

2.根據權利要求1所述的干細胞樣本密度分離液，其特征在于：

所述的腦蛋白水解物為選自下列產品之一：國藥準字H20052182、國藥準字H20003386、國藥準字H20003384或國藥準字H20003385；

所述的腦蛋白水解物的組分含量為0.3-15％；

所述的水溶液的水為滅菌注射用水。

3.根據權利要求2所述的干細胞樣本密度分離液，其特征在于：

所述1號液的氯化鈉注射液組分含量為0.3-12％或磷酸鹽緩沖液的pH為7.1-7.4，其中的腦蛋白水解物組分含量為0.8-6％；

所述2號液的羥乙基淀粉組分含量為0.5-18％或甲基纖維素組分含量為0.2-8％；

所述3號液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為1.01-1.088g/ml。

4.根據權利要求2所述的干細胞樣本密度分離液，其特征在于：

所述1號液的氯化鈉注射液組分含量為0.5-2％或磷酸鹽緩沖液的pH為7.2-7.4，其中的腦蛋白水解物組分含量為1.5-4.5％；

所述2號液的羥乙基淀粉組分含量為1.5-12％或甲基纖維素組分含量為0.3-5％；

所述3號液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為1.035-1.08g/ml。

5.根據權利要求2所述的干細胞樣本密度分離液，其特征在于：

所述1號液的氯化鈉注射液組分含量為0.9％或磷酸鹽緩沖液的pH為7.4，其中的腦蛋白水解物組分含量為3％；，

所述2號液的羥乙基淀粉組分含量為6％或甲基纖維素組分含量為0.5％；

所述3號液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為1.075g/ml。

6.根據權利要求1至5之一的干細胞樣本密度分離液，其特征在于：

所述的1號液在超濾條件下除菌，2～3號液在100℃-130℃的溫度下，滅菌10-50分鐘。

7.根據權利要求6所述的干細胞樣本密度分離液，其特征在于：

所述的2～3號液在105℃-120℃的溫度下，滅菌15-20分鐘。

8.根據權利要求1～7之一的干細胞樣本密度分離液分離干細胞的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟：

(1)將采集、抗凝后的骨髓、臍帶血或外周血樣品加入到含有1號液稀釋劑的大容量培養液瓶中，得到稀釋樣品；

(2)在步驟(1)的稀釋樣品中加入2號液沉淀劑混勻，靜置，待分層后吸取上層細胞液離心濃縮后得到濃縮樣品；

(3)將步驟(2)的濃縮樣品鋪到3號液上層，然后離心分離，得到干細胞層。

9.根據權利要求8所述的分離干細胞的方法，其特征在于：

所述步驟(1)的骨髓、臍帶血或外周血樣品的采集、抗凝、稀釋均需在無菌條件下完成，其采集、抗凝方法分別為：

骨髓血采集：采用髂后上棘，局麻骨穿方法，使用采髓針采集骨髓，采集骨髓用的針管中先抽取1-1.5ml枸櫞酸鈉抗凝液，再抽取骨髓與枸櫞酸鈉抗凝液合計為5ml，依次方法采集，收集采集的骨髓注入無菌瓶中，得到骨髓血預處理樣品；

臍帶血的采集：在產婦胎盤脫落后，使用單包含枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋，將其采血袋上的針頭插入臍靜脈中，一邊采集一邊輕輕晃動采血袋，使抗凝液與臍帶血充分結合，得到臍帶血預處理樣品；

外周血采集：對被采血者手臂進行消毒，使用含有枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋，將采血袋上的針頭插入手臂靜脈采集過程中慢慢搖動采血袋，使抗凝液與外周血充分結合，得到外周血預處理樣品。

10.根據權利要求9所述的分離干細胞的方法，其特征在于：

(1)在所述步驟(1)中，經采集、抗凝后的骨髓血、臍帶血或外周血預處理樣品與1號液的體積比為1∶1，得到稀釋樣品；

(2)在所述的步驟(2)中，稀釋樣品與2號液的體積比為2∶1，再經過搖勻1-8分鐘，放置3分鐘-3小時，待分層后吸取上層細胞液，分裝至50ml離心管中，以500-4000轉/分鐘離心1-20分鐘，搜集下層細胞液，得到濃縮樣品；

(3)將步驟(2)得到濃縮樣品用生理鹽水稀釋后鋪在3號液上，以500-4000轉/分鐘離心1-60分鐘，收集存在于整個離心管中間位置的約2-4mm厚的油狀干細胞層；

(4)將收集的干細胞層用生理鹽水清洗1-5次，再用生理鹽水稀釋至臨床使用體積即可。