[發(fā)明專(zhuān)利]一種構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210016512.8
• 申請(qǐng)日: 2012-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102559845A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸玲;雍陽(yáng)陽(yáng);陳晶晶
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/44
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/44;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法，包括以下步驟：

（1）構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型：對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行24孔板種板，毎孔接種量為2*10⁴個(gè)處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁率達(dá)到60—80%時(shí)進(jìn)行分組，分別設(shè)置正常組，模型組，正對(duì)照組和加藥組；

正常組為貼壁率達(dá)到60—80%?正常巨噬細(xì)胞RAW264.7繼續(xù)培養(yǎng)24?h；

模型組為在貼壁率達(dá)到60—80%?的RAW264.7巨噬細(xì)胞中加入終濃度為70?μg/mL的氧化低密度脂蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)24?h后形成泡沫細(xì)胞；

正對(duì)照組為貼壁率達(dá)到60—80%?的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70?μg/mL的氧化低密度脂蛋白和終濃度為100ug/mL的辛伐他丁繼續(xù)培養(yǎng)24?h；

藥物組為貼壁率達(dá)到60—80%?的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70?μg/mL的氧化低密度脂蛋白和終濃度和終濃度依次為50?μg/mL、100?μg/mL、200?μg/mL的濃度梯度的目的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24?h；

（2）細(xì)胞泡沫化程度的形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基用PBS?沖洗細(xì)胞數(shù)次，中性甲醛固定30?min?后加入油紅O?染液，37℃染色10?min，60%異丙醇脫色后進(jìn)行倒置顯微鏡觀察并拍照；

（3）泡沫細(xì)胞脂流出的檢測(cè)：12孔板按每孔2×10⁴細(xì)胞數(shù)接種巨噬細(xì)胞RAW264.7，細(xì)胞融合達(dá)70-80%?按上述第（1）步驟中方法分組為正常組、模型組、正對(duì)照組、藥物組，棄掉陳舊培養(yǎng)基，換成10%?無(wú)脂蛋白血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24?h后進(jìn)行脂流出的檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法，其中所述脂流出檢測(cè)的方法是：培養(yǎng)24h后用PBS洗板3次，每次1mL/孔；每孔中加入1mL的PBS，細(xì)胞刮小心刮取，轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液入相應(yīng)的玻璃管，室溫，離心，800?rpm，2?min；移走上面PBS，迅速加入體積比3:2的己烷:異丙醇溶液，900μL/每孔，提脂，室溫放置30?min；將溶液平均分兩份分別移入4?mL的EP管中，一份用于測(cè)定游離膽固醇，一份用于測(cè)定總膽固醇；總膽固醇減去游離膽固醇得到膽固醇酯。