[發明專利]一種構建泡沫細胞模型檢測食用菌中降血脂有效成分的方法

無效

• 申請號: 201210016512.8
• 申請日: 2012-01-19
• 公開（公告）號: CN102559845A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 陸玲;雍陽陽;陳晶晶
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于生物細胞學中構建泡沫細胞模型對藥用食用真菌中降血脂有效成分進行篩選的方法。

背景技術

泡沫細胞指富含脂質的吞噬細胞。細胞漿內脂質在制片過程中被有機溶劑溶解而抽提,染色后呈淡色泡沫狀結構而得名。泡沫細胞形成是動脈粥樣硬化形成的早期事件,在血管內皮發生損傷的情況下，血液中的單核細胞通過內皮間隙,在內膜下轉化為巨噬細胞。巨噬細胞介導滲入血管內皮下的低密度脂蛋白膽固醇發生氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白膽固醇，并主要通過A型清道受體吞噬大量氧化型低密度脂蛋白膽固醇,導致細胞內脂質堆積,形成泡沫細胞。越來越多的泡沫細胞堆積在一起形成脂質條紋乃至脂質斑塊。

傳統的檢測降血脂藥物的方法特別是食用藥用真菌中提取到混合物和分離得到的活性物質的方法大多為構建高血脂小鼠模型，但是動物模型具有個體差異大，受操作和環境影響大，用藥量大并且后期藥效的檢測方式復雜，試驗周期長耗時耗力，不能進行大規模的應用。

發明內容

?為了解決現有技術存在的不足，本發明提供一種構建泡沫細胞模型檢測食用菌中降血脂有效成分的方法，有效地解決了目前存在的難題。

?????本發明所述的構建泡沫細胞模型檢測食用菌中降血脂有效成分的方法，包括下述步驟：

（1）構建泡沫細胞模型：對小鼠單核細胞-巨噬細胞RAW264.7進行24孔板種板，毎孔接種量為2*10⁴個處于對數期的細胞，培養至細胞貼壁率達到60—80%時進行分組，分別設置正常組，模型組，正對照組和加藥組；

正常組為貼壁率達到60—80%正常巨噬細胞RAW264.7繼續培養24?h；

模型組為在貼壁率達到60—80%?的RAW264.7巨噬細胞中加入終濃度為70?μg/mL的氧化低密度脂蛋白進行誘導，繼續培養24?h后形成泡沫細胞；

正對照組為貼壁率達到60—80%?的巨噬細胞中同時加入終濃度為70?μg/mL的氧化低密度脂蛋白和終濃度為100?μg/mL的辛伐他丁繼續培養24?h；

藥物組為貼壁率達到60—80%?的巨噬細胞中同時加入終濃度為70?μg/ml的氧化低密度脂蛋白和終濃度依次為50?μg/mL、100?μg/mL、200?μg/mL的濃度梯度的目的藥物繼續培養24?h。

（2）細胞泡沫化程度的形態學觀察：培養24h后，吸去培養基用PBS?沖洗細胞數次，中性甲醛固定30?min?后加入油紅O?染液，37℃染色10?min，60%異丙醇脫色后進行倒置顯微鏡觀察并拍照；

（3）泡沫細胞脂流出的檢測：12孔板按每孔2×10⁴細胞數接種巨噬細胞RAW264.7，細胞融合達70-80%按上述第（1）步驟中方法分組為正常組、模型組、正對照組、藥物組，棄掉陳舊培養基，換成10%無脂蛋白血清的DMEM培養基培養，繼續培養24h后進行脂流出的檢測。

本發明中所述脂流出檢測的方法是：培養24?h后用PBS洗板3次，每次1mL/孔；每孔中加入1?mL的PBS，細胞刮小心刮取，轉移細胞混懸液入相應的玻璃管，室溫，離心，800?rpm，2?min；移走上面PBS，迅速加入體積比3:2的己烷:異丙醇溶液，900μl/每孔，提脂，室溫放置30?min；將溶液平均分兩份分別移入4?mL的EP管中，一份用于測定游離膽固醇，一份用于測定總膽固醇；總膽固醇減去游離膽固醇得到膽固醇酯。

本方法是基于細胞學上的降血脂藥物的篩選和藥效的檢測，具有用藥量少，檢測周期短，操作簡單藥品消耗少，受環境因素影響小，并且藥效檢測具有很高的承認度等一系列優點，可以為食用藥用真菌中提取的具有降血脂藥物的檢測和篩選提供可靠的平臺。通過實驗檢測，以辛伐他丁為正對照，在構建的泡沫細胞模型上我們的杏鮑菇水提多糖混合物PEPE（Pleurotus?eryngii?water-soluble?polysaccharidicextracts）具有很好的促進泡沫細胞的脂流出，與前期動物細胞模型上降血脂功效的檢測效果一致。

本發明不僅可以對大型食用藥用真菌中的有效降血脂活性成分進行檢測和篩選，對于其它合成材料或生物活性提取物中的相關降血脂有效成分也能進行鑒定和篩選，并且可以為降血脂在細胞水平上的機理的研究提供依據，具有良好的學術價值和應用前景。

附圖說明

圖1是細胞泡沫化程度的形態學觀察照片。

圖2泡沫細胞脂流出檢測。

具體實施方式