[發(fā)明專利]一種牛α-乳白蛋白的定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210015743.7
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN102590413A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任一平;賴世云;張京順;蔡增軒;黃百芬;韓見龍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/89;G01N30/06
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種乳或乳制品中熱變性和非變性牛α-乳白蛋白的定量檢測方法。

(二)背景技術(shù)

牛α-乳白蛋白(Bovine?α-Lactalbumin)是由123個(gè)氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)緊密的單體球蛋白，含有4個(gè)二硫鍵，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，平均分子量為14178道爾頓。牛α-乳白蛋白是必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源，它與人乳中的α-乳白蛋白具有76％的氨基酸組成相似度。其主要生理作用在于與金屬離子的結(jié)合能力，還含有豐富的色氨酸，有助于提高血液中復(fù)合胺的釋放，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育，具有很好的營養(yǎng)價(jià)值。市場上出現(xiàn)了大量添加牛α-乳白蛋白的嬰幼兒配方奶粉，由于不同加工工藝等原因造成產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，但又沒有建立準(zhǔn)確有效的評價(jià)檢測方法。

目前國內(nèi)、外用于牛α-乳白蛋白的檢測方法仍以SDS-PAGE為主，該法為半定量方法，無法進(jìn)行準(zhǔn)確定量，由于操作繁瑣無法在一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣；有人提出了應(yīng)用GPC-UV的檢測方法，由于分辨力差而只能用于高含量的原料檢測；任一平等人建立了RPLC-ESI-MS測定嬰幼兒配方中的牛α-乳白蛋白的方法，樣品經(jīng)直接提取，根據(jù)蛋白在電噴霧離子化條件下會(huì)產(chǎn)生多電荷離子的原理，采用選擇離子掃描模式(SIR)進(jìn)行檢測，因而只限于試樣中非變性的牛α-乳白蛋白定量檢測，而無法測定因加熱而變性的牛α-乳白蛋白。經(jīng)查詢，至今為止還未發(fā)現(xiàn)可同時(shí)測定乳與乳制品中熱變性和非變性牛α-乳白蛋白的準(zhǔn)確方法。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種針對不同含量、基質(zhì)的牛乳及其制品，可準(zhǔn)確測定其中熱變性和非變性的牛α-乳白蛋白含量的定量檢測方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種牛α-乳白蛋白的定量檢測方法，所述方法包括：

(1)樣品處理：

取待測樣品1～2克，用水溶解并稀釋至最終總蛋白含量約為1mg/mL，準(zhǔn)確吸取500μL樣品溶液，加入20μL濃度為25μmol/L的內(nèi)標(biāo)物溶液、480μL濃度為500mmol/L的NH₄HCO₃溶液和10μL濃度為500mmol/L的DTT溶液，50℃恒溫30min后取出冷卻至室溫，加入30μL濃度為500mmol/L的IAA溶液，暗室靜置30分鐘，加入10μL濃度為100mmol/L的CaCl₂溶液和30μL濃度為100μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃恒溫8小時(shí)酶解，取出酶解樣液加入20μL甲酸，室溫靜置1小時(shí)后，將酶解液定容至2mL，所得溶液作為進(jìn)樣液進(jìn)行下一步質(zhì)譜分析；

本發(fā)明方法適用于全部含牛α-乳白蛋白的樣品，原料包括濃縮乳清粉、α-10乳清蛋白粉、脫鹽乳清粉、生鮮乳等；產(chǎn)品包括嬰幼兒配方粉、脫脂乳粉、全脂乳粉、高溫殺菌奶、巴氏消毒奶、發(fā)酵型酸奶等。具體按如下比例加水進(jìn)行溶解和稀釋：待測樣品為配方奶粉時(shí)，取樣品1.0克，加水溶解并定容至100ml即可；待測樣品為乳清白蛋原料時(shí)，取樣品1.0克，用水溶解并稀釋至1L；待測樣品為液態(tài)乳時(shí)，取樣品5克，用水稀釋至100ml即可。

所述內(nèi)標(biāo)物為氨基酸序列為VKKILDKVGINNYWLAHKALCSEKL的肽段；

(2)曲線配制：配制牛α-乳白蛋白特征肽濃度分別為10、25、50、100、250、500、1000nmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，且在各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入相同濃度250nmol/L的內(nèi)標(biāo)特征肽；

所述牛α-乳白蛋白特征肽為氨基酸序列為VGINYWLAHK的肽段；所述內(nèi)標(biāo)特征肽為氨基酸序列為VGINNYWLAHK的肽段；

(3)分離檢測：將標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品酶解所得溶液在相同的液相色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行分離檢測，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液及檢測樣液中牛α-乳白蛋白特征肽和內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積；

(4)濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度及其牛α-乳白蛋白特征肽和內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積，做線性回歸，得線性方程y＝kx+b，其中y為牛α-乳白蛋白特征肽與內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積的比值；x為牛α-乳白蛋白特征肽的濃度，單位nmol/L；再根據(jù)此方程及檢測所得樣液中牛α-乳白蛋白特征肽和內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積，將樣液中牛α-乳白蛋白特征肽和內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積比值代入線形方程中，計(jì)算出樣液中牛α-乳白蛋白特征肽的絕對濃度n_a；

(5)含量計(jì)算：由公式1計(jì)算檢測樣品中牛α-乳白蛋白的含量C_x；

公式1：C_x＝10^-10·M·N·n_a，其中