[發(fā)明專利]一種牛α-乳白蛋白的定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210015743.7
• 申請(qǐng)日: 2012-01-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102590413A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任一平;賴世云;張京順;蔡增軒;黃百芬;韓見(jiàn)龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/89;G01N30/06
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種牛α-乳白蛋白的定量檢測(cè)方法，所述方法包括：

(1)樣品處理：取待測(cè)樣品1～2克，用水溶解并稀釋至總蛋白含量為1mg/mL，準(zhǔn)確吸取500μL上述樣品溶液，加入20μL濃度為25μmol/L的內(nèi)標(biāo)物溶液、480μL濃度為500mmol/L的NH₄HCO₃溶液和10μL濃度為500mmol/L的DTT溶液，50℃恒溫30min后取出冷卻至室溫，加入30μL濃度為500mmol/L的IAA溶液，暗室靜置30分鐘，加入10μL濃度為100mmol/L的CaCl₂溶液和30μL濃度為100μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃恒溫8小時(shí)酶解，取出酶解樣液加入20μL甲酸，室溫靜置1小時(shí)后，將酶解液定容至2mL，所得溶液作為進(jìn)樣液進(jìn)行質(zhì)譜分析；所述內(nèi)標(biāo)物為氨基酸序列為VKKILDKVGINNYWLAHKALCSEKL的肽段；

(2)曲線配制：配制牛α-乳白蛋白特征肽濃度分別為10、25、50、100、250、500、1000nmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并且在各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入相同濃度250nmol/L的內(nèi)標(biāo)特征肽；

所述牛α-乳白蛋白特征肽為氨基酸序列為VGINYWLAHK的肽段；所述內(nèi)標(biāo)特征肽為氨基酸序列為VGINNYWLAHK的肽段；

(3)分離檢測(cè)：將標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品酶解所得溶液在相同的液相色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行分離檢測(cè)，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液及檢測(cè)樣液中牛α-乳白蛋白特征肽和內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積；

(4)濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度及峰面積，做線性回歸，得線性方程y＝kx+b，其中y為牛α-乳白蛋白特征肽與內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積的比值；x為牛α-乳白蛋白特征肽的濃度，單位nmol/L；再根據(jù)此方程及檢測(cè)所得樣液中牛α-乳白蛋白特征肽和內(nèi)標(biāo)物特征肽的峰面積，計(jì)算出樣液中牛α-乳白蛋白特征肽的絕對(duì)濃度n_a；

(5)含量計(jì)算：由公式1計(jì)算檢測(cè)樣品中牛α-乳白蛋白的含量C_x；

公式1：C_x＝10^-10·M·N·n_a，其中

C_x：樣品中牛α-乳白蛋白的濃度，單位g/100g；

M：牛α-乳白蛋白分子量，14178g/mol；

N：樣品稀釋倍數(shù)；

n_a：檢測(cè)樣液中牛α-乳白蛋白特征肽的絕對(duì)濃度，nmol/L。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)液相色譜分離條件如下：色譜柱：BEH?300?C18色譜柱；柱溫為40℃，流動(dòng)相為0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)質(zhì)譜檢測(cè)條件如下：牛α-乳白蛋白特征肽的母離子為601m/z，子離子210m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為35eV，子離子110m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為40eV；內(nèi)標(biāo)物特征肽的母離子為659m/z，子離子210m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為40eV，子離子110m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為45eV。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)質(zhì)譜儀器條件如下：毛細(xì)管電壓：3.5kv，錐孔電壓：35kv，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：900L/min，錐孔反吹氣流量：30L/hr，碰撞室壓力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，離子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，離子能量2：1.0；離子源溫度：150℃，提取器電壓：3.0V，入口透鏡電壓：0.5V，出口電壓：0.5V，碰撞梯度：1.0。