[發(fā)明專利]一種新型連接酶反應介導的擴增方法及用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210015431.6
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN102559661A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 王小波
• 申請（專利權）人: 廈門基科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市誠得知識產(chǎn)權代理事務所 35209
• 代理人: 方惠春

技術領域

本發(fā)明涉及一種擴增方法，尤其涉及一種連接酶反應介導的擴增方法。?

背景技術

核酸檢測技術已被廣泛應用于分子遺傳學、免疫學、腫瘤學及微生物學等方面的臨床診斷。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，一些新的核酸檢測方法也不斷涌現(xiàn)，其中，連接酶依賴的檢測技術就是其中的一類。連接酶是一種封閉DNA或RNA?鏈上缺口(Nick)的酶，借助NAD⁺或ATP水解提供的能量催化2條核酸單鏈的3`端羥基和5`端磷酸基團反應形成磷酸二酯鍵。連接酶依賴的檢測技術主要是通過核酸雜交原理及其在缺口連接處的保真性實現(xiàn)的。1988年，Landegren首先發(fā)明了連接酶體外突變檢測技術OLA，并利用該技術鑒定了編碼導致地中海鐮刀型細胞貧血癥的β球蛋白的突變等位基因β^S和野生型等位基因β^A之間的單堿基差異。1991年，Barany提取出耐熱連接酶并發(fā)展了連接酶檢測反應(Ligase?detection?reaction,?LDR)和連接酶鏈式反應(Ligase?chain?reaction,?LCR)技術。這兩項技術的提出對連接酶依賴的體外檢測技術的發(fā)展及應用具有深遠的意義，但是都存在非特異信號干擾、易用性差等問題。其后，連接酶反應技術結合PCR技術,?衍生出了一系列新的檢測技術。如LDR/PCR、MLPA、PLP(Padlock?probe)、MIP(Molecular?inversion?probe)等，這些技術主要通過連接酶反應實現(xiàn)目的基因的“特異轉化”，再由PCR系統(tǒng)擴增轉化后的特異產(chǎn)物實現(xiàn)檢測。該類技術都表現(xiàn)出較高的檢測通量，甚至能夠實現(xiàn)>10000重的基因分型（MIP技術），但是都存在非特異信號的干擾較嚴重，容易出現(xiàn)假陽性的問題。這類技術的非特異信號主要來源于：1.非特異連接酶反應；2.非特異的PCR擴增。LDR/PCR、MLPA技術由于受到這兩種非特異的影響，故檢測的靈敏度有限，且非特異信號能被檢測出，存在假陽性的風險。PLP及MIP技術采用了外切酶消化未連接雜交探針的方法，在一定程度上消除了雜交探針在PCR反應中的非特異擴增，但是當檢測重數(shù)較高時，仍然會受到非特異連接的影響，假陽性的出現(xiàn)仍不可避免。?

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是：提供一種克服連接酶反應及PCR的非特異信號干擾的擴增方法。該技術實現(xiàn)了降低反應背景、增強性噪比、避免假陽性等目的。

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種新型連接酶反應介導的擴增方法，通過三條連接探針的連接酶反應實現(xiàn)下游的通用擴增及檢測，其特征在于：每條連接探針由特異雜交序列及填入的標簽序列組成，具體為：目標序列7從3’端到5’端分別分為A段，B段，C段和D段，連接探針a為A段的反向互補序列2加上一段上游引物標簽序列1組成，即2－1；?連接探針b為C段的反向互補序列3’，加上B段和C段之間的檢測標簽序列4和B段的反向互補序列3組成，即3’-4-3；?連接探針c為一段下游引物結合標簽序列6加上D段的反向互補序列5組成，即6－5；所述的序列1、4、6為不與目標序列雜交的序列。

所述的上游引物標簽序列1、下游引物結合標簽序列6和檢測標簽序列4的設計原則分別為：GC含量適中，Tm值為55-70℃，長度為18-35bp，與目標基因組無較高同源性。此處的無較高同源性是指同源性低于50%。

所述的序列2、3、3’、5為?GC含量適中，Tm值為50-70℃，與目標序列特異雜交。

所述的連接探針a、b和c的序列中除去序列1、4、6外均為特異雜交序列。。

本發(fā)明還提供一個試劑盒，包含上述的連接探針a、b和c，及試劑盒的用途。

本發(fā)明還提供一種芯片，包含上述的連接探針a、b和c，及芯片的用途。

所述目標序列的A、B、C和D段相互之間無間隔。

目標序列的GC含量適中，無重復序列或同源性較高的序列出現(xiàn)，連接探針特異雜交的位置最好不要有SNP或突變位點的出現(xiàn)，除非是SNP或突變檢測實驗中，SNP或突變位點最好位于連接探針的3’端。

本發(fā)明還涉及一種連接酶反應介導的擴增方法用途。

所述試劑盒、芯片和連接酶反應介導的擴增方法在進行基因序列分型、定量等檢測中的用途。

本發(fā)明檢測的是已知目標序列，可檢測突變位點、SNP位點、各物種目標基因（如細菌及病毒的目標DNA）的定性及定量反應等。